犊牛魏氏梭菌的分离鉴定及致病性研究

陈 萌，苏 波，胡树贤，刘 朋，程子龙，张建东，刘思当

（1. 山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2. 山东省禹城市畜牧兽医局，山东禹城 251200；3. 泰安市畜牧兽医局，山东泰安 271000）

魏氏梭菌又称产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），是一种广泛存在于自然环境中，能够引发人和动物相关疾病的重要病原体[1]。该菌也是肠道中的常在菌之一，在一定条件下，可以引起畜禽的气性坏疽、肠毒血症、坏死性肠炎、猝死症，以及人的气性坏疽和食物中毒等[2-4]。该菌致病作用主要在于它所产生的毒素。目前已发现的毒素有20种，根据其产生的致死性毒素α、β、ε和ι，可将其分为A、B、C、D、E 5种毒素型[5]。

2017年1月，山东省某规模化奶牛场10～20日龄犊牛出现腹泻、拉血便等症状，并有部分犊牛突然死亡。经过尸体剖检、病理组织学检查、细菌分离鉴定、PCR及动物致病性试验等，确诊造成该牛场发病的病原为A型魏氏梭菌。根据药敏试验，发现该菌对青霉素等较为敏感，并因此为牛场制定了相应的防治方案，使疫情得以迅速控制，从而降低了牛场经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 无菌采集病死犊牛的心、肝、脾、肺、肾、肠道等器官组织及肠内容物。对其中一份器官组织于10%福尔马林溶液固定，另一份立即放冰箱冰冻保存。

1.1.2 实验材料 引物：上海生工有限公司合成；rTaq酶、DNA Marker DL 2000：购自Takara公司；ddH2O：本实验室配制；凝胶回收试剂盒：购自BIOMEGA 公司；DNA/RNA提取试剂盒：购自北京全式金生物有限公司；血液琼脂培养基、硫乙醇酸盐培养液：参照兽医微生物学实验指导制作或配制[6]。

1.1.3 试验动物 健康昆明小鼠：购自泰安市泰邦技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理学诊断 剖检病死牛，观察组织器官的眼观病理变化；取病料于10%福尔马林溶液固定，按照常规方法制作石蜡切片[7]，HE染色，镜检组织病理学变化。

1.2.2 细菌分离培养 将无菌采集的肝、肺等组织，分别接种于血液琼脂培养基，于37 ℃恒温培养箱中厌氧培养1 d，观察细菌生长情况及菌落形态。

1.2.3 染色镜检 挑取单个菌落置于载玻片上，分别进行革兰氏染色、瑞氏染色，镜检观察细菌染色特性及形态特征。

1.2.4 生化鉴定 取血液琼脂培养基中分离菌的纯培养物，参照文献[8]，用杜氏小管进行常规生化试验。

1.2.5 16SrRNA分子鉴定 设计检测引物，进行PCR扩增；将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后回收目的基因片段并测序。

1.2.6 主要毒素基因PCR鉴定 根据魏氏梭菌的5种主要毒素基因序列（CPA、CPB、CPE、ETX、ITXA），设计合成引物进行PCR检测，并将目的条带胶回收测序。引物序列信息见表1。

表1 PCR鉴定引物序列信息

1.2.7 药敏试验 使用本实验室自制的药敏片进行药敏试验，按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判定。

1.2.8 动物致病性试验 肠内容物毒素致病性试验：无菌采集病死犊牛肠内容物，10 000 r/min离心5 min，取上清，用0.22 μm滤器过滤；取健康小鼠4只，其中2只尾静脉注射0.3 mL滤液，另外2只注射0.3 mL生理盐水作为阴性对照，观察小鼠的情况。分离菌毒力致病性试验：取健康昆明小鼠9只，随机分为3组，每组3只。取分离菌的纯培养物，分别腹腔注射第1、2组健康小鼠0.1、0.2 mL/只，第3组作为阴性对照，每只注射0.2 mL生理盐水。接种后分开饲养，24 h内观察小鼠情况。剖检小鼠，观察组织器官的病理学变化，并采集心、肝、肺、肾等组织样品，分离细菌。

2 结果

2.1 剖检病变及病理组织学检查

剖检病死犊牛，可见肺脏尖叶实变（图1-A），膈叶气肿；肠系膜淋巴结暗红色肿大，空肠鼓气，内含暗红色内容物（图1-B）；盲肠与结肠出血鼓气（图1-C、1-D）；直肠黏膜面有较多出血点（图1-E）；真胃黏膜表面有较多小溃疡灶（图1-F）。

图1 剖检病变

通过组织病理学观察，可见肺泡壁增宽，肺泡壁毛细血管充血、出血（图2-A）；脾脏血管扩张充血（图2-B）；肠绒毛断裂，肠黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜固有层和黏膜下层明显充血、出血、水肿，肌层肌纤维断裂（图2-C、2-D、2-E）；胃黏膜上皮细胞坏死脱落（溃疡面），黏膜固有层大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润（图2-F）。

图2 组织病理学观察

2.2 细菌培养鉴定

经血液琼脂培养基37 ℃培养1 d后，发现出现黑色圆形菌落，有溶血现象。挑菌，经革兰氏染色镜检，可见两端钝圆、粗大杆菌样革兰氏阳性菌。

2.3 生化试验鉴定

分离菌生化试验鉴定结果见表2。生化反应结果与《伯杰细菌手册》对照，各项指标均与所述鉴定标准相符，综合培养及生化试验结果，初步判断所分离菌为魏氏梭菌。

表2 生化试验鉴定结果

2.3 PCR鉴定

用DNA提取试剂盒，对分离菌提取DNA；以分离菌总DNA为模板，使用设计的16S基因检测引物进行扩增，得到大于1 000 bp的条带（目的片段为1 450 bp）；将PCR扩增条带进行胶回收，连接T载体后进行测序；将得到的序列与BLAST比对，发现与魏氏梭菌标准株ATCC13124的同源性为97.9%，表明该分离菌为魏氏梭菌。

使用魏氏梭菌的5种主要毒素基因进行PCR扩增，仅有CPA得到一条大于250 bp的条带（目的条带为430 bp）；将该PCR产物测序，序列结果与GenBank中发表的α毒素基因比对，发现同源性为99%，证实该毒素为魏氏梭菌α毒素。因此，该分离菌为A型魏氏梭菌。具体鉴定结果见图3。

图3 16s通用引物及主要毒素基因PCR扩增结果

2.4 药敏试验

分离菌对对头孢噻呋、恩诺沙星、青霉素表现为极敏，对林可霉素表现为高敏，对氟苯尼考、庆大霉素表现为中敏，对新霉素和多西环素完全耐药（表3）。

表3 药敏试验结果

2.5 动物试验

2.5.1 肠内容物毒素试验 尾静脉注射滤液的2只小鼠1 d内全部死亡，阴性对照组小鼠存活且无异常，证明肠内容物中有毒素存在。

2.5.2 分离菌毒力试验 腹腔注射分离菌的6只小鼠1 d内全部死亡，阴性对照组小鼠全部存活。经病理剖检可见，腹腔注射分离菌组小鼠肺脏充血、出血；肠道鼓气，肠腔内充满血红色浆液；肝脏有出血。接种环无菌穿刺病死小鼠肝脏，血琼脂平板接种，37 ℃厌氧培养1 d，挑取单菌落于硫乙醇培养液中増菌培养，经革兰氏染色及鉴定，得到与分离株相同的菌株。上述结果表明，分离株对小鼠具有较强的致病性。

3 讨论

魏氏梭菌为条件性致病菌，当机体处于严重应激状态或其他原因造成免疫力下降时，会大量增殖并产生毒素引起疾病[9-10]。近年来该病在规模化肉牛场、奶牛场时有发生，给养牛业造成了重大危害。魏氏梭菌主要产生α、β、ε和ι 4种毒素，所致疾病通常由一种或多种毒素引起[5，11-12]。各型魏氏梭菌均可产生α毒素。它是魏氏梭菌最重要的致病毒素，也是A型魏氏梭菌最主要的毒力因子[13-14]。α毒素具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性[15-18]。感染期间，α毒素会干扰免疫反应，导致局部坏死，从而促进魏氏梭菌生长。α毒素也会诱导宿主细胞裂解，为魏氏梭菌生长提供营养，尤其是许多必需氨基酸[12]。

该牛场犊牛发病于冬季，受寒冷天气影响，其免疫力下降，导致肠道内魏氏梭菌大量增殖，在肠道内产生大量的外毒素。这些毒素黏附在肠黏膜上皮层，使肠壁黏膜受损通透性增加，进而毒素（细菌和毒素）进入血液循环，引起毒血症（或败血症），从而导致犊牛器官衰竭而急性死亡。

对病死犊牛病理剖检，可见整个肠道鼓气，严重出血，肠腔内存在未消化的凝乳块，病理组织学观察见胃肠黏膜上皮细胞坏死脱落，甚至形成溃疡面，黏膜固有层充血出血；经细菌分离培养，获得1株分离菌。该分离株在血琼脂培养基上形成黑色、圆形菌落，形态特征及培养特性均与以往报道的魏氏梭菌相符；分离株的生化鉴定结果也与魏氏梭菌的生化特性一致；对16S及毒素基因使用PCR进行检测，结果呈阳性；综合以上结果初步确定犊牛死亡是由A型魏氏梭菌感染引起。将分离得到的魏氏梭菌接种小鼠，发现小鼠在较短时间内全部死亡，且从小鼠体内分离到相同病原，进一步确定该牛场发病为魏氏梭菌感染所致。

魏氏梭菌引起的疾病大多迅速致命，往往来不及使用药物治疗，因此预防则显得尤为重要。加强饲养管理及免疫接种，在一定程度上可有效预防魏氏梭菌病的发生。魏氏梭菌致病主要由产生的外毒素所致，但各型菌产生的毒素均不相同，因此只能使用多价苗进行接种。目前，常见的疫苗为针对B、C、D型魏氏梭菌预防的多联苗（如羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-肠毒血症三联四防灭活疫苗），而对于A型魏氏梭菌的预防效果尚未见文献报道。因此，现在亟需研制针对A型魏氏梭菌的新型疫苗。此次疫情发病均为犊牛，在初步诊断的基础上，建议该场及时对未断奶犊牛接种魏氏梭菌铝胶疫苗。对于发病较为缓慢或同舍未发病的牛，口服青霉素预防，病牛注射头孢噻呋钠。另外，注意犊牛舍防风、防寒，加强饲养管理，消除各种应激诱发因素，同时加强牛舍的卫生消毒。通过以上措施，该场疫情得到迅速控制，降低了经济损失。本研究分离鉴定的A型魏氏梭菌为该血清型疫苗与诊断试剂的研发奠定了物质基础。