Omi/HTRA2基因与华中地区汉族人群帕金森病的相关性

陈春暖 陈祥荣 蔡乾昆 叶励超 万琼红 蔡若蔚 王涛

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年人常见的神经系统退行性疾病，其病理特征为黑质纹状体多巴胺能神经元选择性缺失和路易小体形成，其病因和发病机制尚未完全明确，目前认为可能由多因素相互作用引起。除年龄老化和环境因素外，遗传因素是另一个重要的危险因素，可使患病易感性增加。现已知的与PD相关的基因有PARK1-23，其中与线粒体功能障碍相关的基因有Omi/HTRA2、PINK1、PRKN、DJ-1等[1]。线粒体功能障碍是PD发病的重要机制之一。研究发现，靶向干扰Omi/HTRA2基因可使小鼠出现神经变性和PD样表现[2-4]，黑质纹状体发生线粒体复合物Ⅰ选择性缺陷，均表明线粒体功能障碍及Omi/HTRA2在PD的发生中具有重要作用[1，5]。

HTRA2(High temperature requirement A2)基因(PARK13，OMIM #610297)位于人染色体2p13.1，含8个外显子，编码蛋白HtraA2是丝氨酸蛋白酶家族的一员，亦称为Omi，存在于大部分正常组织中，由458个氨基酸残基组成，相对分子质量51 000。Strauss等[6]对德国414例PD患者Omi/HTRA2基因进行测序发现，患者中存在G421T和G1195A突变，且过表达这两种突变体能够明显诱发多巴胺能细胞的蛋白酶失活和线粒体膜功能障碍，细胞对应激诱导的死亡更敏感。在PD患者大脑中发现HtrA2染色阳性的路易小体提示该基因可能是PD的重要候选基因。Unal等[7]在土耳其一多人患有PD和特发性震颤的家系中发现G399S(G1195A)突变，进一步证实Omi/HTRA2基因突变的致病作用。但目前该基因与我国汉族人群PD的相关性研究仍缺乏。本文采用病例对照研究，对Omi/HTRA2基因4-6号外显子进行测序分析，探讨Omi/HTRA2基因与汉族人群散发性PD的相关性，旨在进一步研究遗传因素在PD中的发病机制。

1 对象和方法

1.1研究对象收集2007-09—2012-06华中科技大学同济医学院附属协和医院神经科收治的208例散发性PD患者，女72例，男136例，年龄25～83岁，平均(56.75±12.94)岁。患者均为华中地区汉族人，符合英国脑库PD临床诊断标准，且排除其他神经系统退行性疾病，全部病例无血缘关系及家族史。另选择协和医院汉族人群健康体检者298名作为正常对照组，其中女104名，男194名，年龄23～90岁，平均(51.62±11.33)岁。排除患有PD及其家族史，无脑血管病史、阿尔茨海默病及其他神经系统疾病病史。两组间年龄、性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05)。标本的收集均经本人或家属同意，并经华中科技大学同济医学院医学研究伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1 外周血基因组DNA提取：抽取患者和健康者肘静脉血5 mL，经2%(质量浓度)EDTA抗凝，采用碧云天DNA抽提试剂盒提取外周血白细胞基因组DNA，取适量DNA稀释成30 ng/μL用于后续PCR检测。

1.2.2 PCR扩增：根据Genbank上Omi/HTRA2基因序列，根据4-6号外显子及其两侧的DNA序列用Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，4、5号外显子正向引物：5′-GAAAGTACCTACATCCTGGTATGC -3′；反向引物：5′-GAATGCCCTTCCCCTATTTC-3′；6号外显子正向引物：5′-TGTGGTGGAAATAGGGGAAG-3′；反向引物：5′-TGAAGGGAGACAGCTCTTGTG-3′。PCR反应体系为25 μL，体系内含2×Power Taq PCR MasterMix(BIOTEKE公司)12.5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，基因组DNA(30 ng/μL)1 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，两对引物分别用57.4℃和60.3℃退火30 s，72℃延伸35 s，32个循环，72℃总延伸10 min，终止反应。PCR产物用2%(质量浓度)琼脂糖凝胶电泳，140 V电泳约15 min，荧光灯下观察PCR产物条带，目的条带分别为502 bp和331 bp。目的DNA用EZ Spin柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收并送检测序。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；计数资料比较采用卡方检验；采用DNAMAN7软件比对病例组及对照组Omi/HTRA2基因的4-6号外显子基因序列，寻找突变并计算突变率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有正常对照样品Omi/HTRA2基因4-6号外显子序列经与Genbank上Omi/HTRA2基因序列进行比对后均没有发现突变和单核苷酸多态，将此DNA标本的扩增产物作为正常阴性对照样品。患者测序结果与正常阴性对照进行比对，208例患者4-6号外显子也未发现突变位点。Omi/HTRA2基因4-6号外显子部分测序结果见图1。

3 讨论

线粒体功能障碍被认为是PD发病的重要机制之一。线粒体功能缺失可导致神经细胞突触功能障碍和细胞死亡，从而引起神经变性。因此与线粒体功能缺失相关的遗传因素就成为遗传学研究的热点。自2005年在德国家系中发现Omi/HTRA2突变后，该基因引起很多PD研究者关注。

Omi/HtrA2蛋白是一种位于线粒体膜间隙的丝氨酸蛋白酶，主要在线粒体中剪切，使其具有酶活性及分子伴侣功能。它能够降解错误折叠的蛋白质，当线粒体发生应激反应时具有一定的神经保护功能。随着研究的不断深入，该蛋白还有促凋亡功能，其主要通过两种途径促进细胞凋亡，即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)依赖性途径和非caspase依赖性途径[8]。caspase依赖性途径，即在某些应激条件下Omi/HtrA2被释放到胞浆与抑凋亡蛋白X连锁凋亡抑制因子(XIAP)结合，使XIAPs-caspase复合体解离，或对XIAPs进行降解，激活caspase级联放大反应，发挥促凋亡作用[8-9]。非caspase依赖性途径，则通过其蛋白水解活性降解或清除线粒体抗凋亡蛋白(HIS-associated protein X-1，HAX-1)发挥促凋亡作用[8]。

图1 PD患者Omi/HTRA2基因4-6号外显子PCR产物部分测序结果

Omi/HtrA2作为促凋亡因子，在衰老、缺血再灌注损伤、慢性炎症及神经变性疾病等的细胞凋亡中发挥重要作用。为此，研究Omi/HTRA2基因与PD发生的相关性并寻找干预措施具有重要意义。

但目前关于Omi/HTRA2突变的报道并不多，且结果也存在争议，推测其原因可能是该突变相对少见的缘故。目前发现的两个外显子区突变位于1号和7号外显子，而有关4-6号外显子的报道较少。本研究采用病例对照方法，通过检测我国华中地区208例散发性PD患者和298名健康对照者Omi/HTRA2基因4-6号外显子序列，探讨我国汉族人群Omi/HTRA2基因4-6号外显子在PD中的致病作用。结果显示，在PD组和正常对照组中均未发现4-6号外显子存在突变位点。既往国内研究显示，汉族人群Omi/HTRA2基因G399S(G1195A)杂合子可能是PD的患病因素[10]，这与Strauss等[6]研究一致。该突变位于7号外显子，该基因启动子区5-59A/G位点等位基因A和AA基因型均可能增加PD的发病风险，特别是男性[11]。而该基因4-6号外显子的突变目前罕有报道。本研究结果也未发现这3个外显子区存在突变，或与其本身为罕见突变有关。

综上所述，本研究结果未发现Omi/HTRA2基因4-6号外显子突变，未发现其突变与PD相关，这可能与样本量不足，无法完全代表普通人群有关，也可能和试验方法结果的判定等有关。尽管如此，本研究结果对于中国人群的遗传学研究仍是重要补充，其与PD的相关性尚需进一步研究，特别是进行大样本、多中心的研究，以正确评价Omi/HTRA2基因在PD发病中的作用和应用价值。