盐酸丙卡特罗微生物限度方法学研究

马云艳

摘要：根据《中国药典》2015年版四部通则1105及1106非无菌产品微生物限度检查方法要求，建立盐酸丙卡特罗微生物限度检查方法。方法采用加入冲洗液及薄膜过滤以消除抑菌性。结果表明各试验菌的回收比值均在0.5～2之间，控制菌结果呈阳性。表明该方法可作为盐酸丙卡特罗的常规微生物限度检查方法。

关键词：盐酸丙卡特罗；薄膜过滤

盐酸丙卡特罗属于选择性β2受体激动剂，对支气管的β2受体具有高度选择性，其支气管扩张作用强而持久。本文讨论其作为口服制剂的原料药使用，根据《中国药典》2015年版四部通则1105及1106非无菌产品微生物限度检查方法要求，应进行需氧菌、霉菌及酵母菌总数测定及大肠埃希菌控制菌检查，本次试验对盐酸丙卡特罗的需氧菌、霉菌及酵母菌计数及控制菌检查分别进行讨论。

1 仪器与试验用品

1.1 试验菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]

枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]

铜绿假单胞菌[CMCC（B） 10104]

白色念珠菌 [CMCC（F） 98001]

黑曲霉[CMCC（F） 98003]

1.2 培养基、稀释液、冲洗液等

胰酪大豆胨琼脂培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基

PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液

氯化鈉

胰酪大豆胨液体培养基

麦康凯液体培养基

麦康凯琼脂培养基

聚山梨酯80

1.3仪器

生化培养箱

立式压力蒸汽灭菌器

电热恒温鼓风干燥箱

Milliflex PLUS微生物过滤系统

1.4 样品

盐酸丙卡特罗

2微生物限度方法验证试验

2.1菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养2～3天，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出转移至空无菌试管作为原菌液，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

2.2供试液的制备

取本品10g，加含0.1%聚山梨酯80的PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1：10供试液。

2.3 需氧菌总数测定方法试验

2.3.1 平皿法

（1）试验组：取1：10供试液9.9ml，加入适量浓度的0.1ml枯草芽孢杆菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供试液，取0.1ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供试液，备用。

（2）菌液组：取适量浓度的0.1ml枯草芽孢杆菌菌液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10ml，混匀，制成菌含量<100cfu/ml的菌悬液，吸取0.1ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，备用。

（3）供试品对照组：取试验组项下1：10供试液0.1ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。

2.3.2结论

通过培养，枯草芽孢杆菌回收比值小于0.5，说明本品对枯草芽孢杆菌有抑制作用，故不采用该法。

2.3.3 薄膜过滤法

（1）试验组：采用薄膜过滤法，先用少量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取1：10供试液1ml，加至100ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，再加入菌含量<100cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌液，混匀后，全量倒入Milliflex PLUS微生物过滤系统的Microfil泵头上的250ml滤杯内，抽滤完全，将滤膜用镊子取下贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。同法操作并依次加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。

（2）菌液组：取相应稀释液替代供试液，同试验组操作。按规定温度培养并计数。

（3）供试品对照组：取制备好的供试液，以稀释液代替菌液，同试验组操作。

（4） 阴性对照组：取相应稀释液替代供试液，不加菌液，同试验组操作。

2.4霉菌及酵母菌总数测定试验

（1）试验组：取1：10供试液9.9ml，加入适量浓度的0.1ml白色念珠菌菌液，制成菌含量<100cfu/ml的供试液，取1ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。同法制备含黑曲霉的供试液，备用。

（2）菌液组：取适量浓度的0.1ml白色念珠菌菌液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10ml，制成菌含量<100cfu/ml的菌悬液，吸取1ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。同法制备含黑曲霉的菌悬液，备用。

（3）供试品对照组：取需氧菌试验组项下1：10供试液1ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。

2.5 结果

通过三次试验结果表明，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液组菌落数的比值均在0.5～2范围内，各试验菌的回收试验均符合《中国药典》2015年版中的规定，可照所用的供试液制备方法和计数法进行需氧菌总数、霉菌和酵母总数计数。

3 控制菌检查方法验证试验

3.1试验菌种：

大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]

3.2菌液制备：

取大肠埃希菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨琼脂培养基中，30～35℃培养18～24小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数约为不大于100cfu的菌悬液。

3.3 验证方法

（1）试验组：取1：10的供试液10ml和规定量大肠埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，培养18～24小时。

（2）阳性对照组：取规定量的大肠埃希菌（不大于100cfu）加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养18～24小时。

（3）阴性对照组：阴性对照组：取10ml稀释液加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，培养18～24小时。

（4）取试验组、阳性对照组、阴性对照组上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

3.4结果

通过三次试验表明，阳性对照组检出大肠埃希菌；试验组检出大肠埃希菌，阴性对照组未检出大肠埃希菌。结果符合《中国药典》2015年版中的规定，方法可行，可照该方法进行大肠埃希菌控制菌试验。

4 讨论

盐酸丙卡特罗微生物限度方法验证中，需氧菌总数测定采用平皿法，对枯草芽孢杆菌有抑菌性，故加入冲洗液并采用薄膜过滤法进行试验，而霉菌及酵母菌总数测定中供试品对白色念珠菌、黑曲霉无抑菌性，故采用平皿法进行试验。取1：10供试液10ml至100ml胰酪大豆胨液体培养基，进行控制菌（大肠埃希菌）检查。