疏血通脉胶囊对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用研究

陈朝 刘泰 黄一挚 黄敏 甘典辉 龚敏阳 黎红丹

摘 要 目的：研究疏血通脈胶囊对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经保护作用。方法：将36只SD大鼠随机分为假手术组（等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）、尼莫地平组（0.01 g/kg）和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组（0.32、0.64、1.28 g/kg），每组6只。除假手术组外，其余5组大鼠均以线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型，造模成功后灌胃相应药物，每天1次，连续28 d。于给药前及给药后3、7、14、28 d采用改良神经功能评分法进行大鼠神经功能缺损评分；给药后28 d以三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）法检测大鼠脑组织皮质区神经细胞凋亡情况，以免疫组化法检测大鼠脑组织皮质区脑源性神经营养因子（BDNF）表达情况。结果：与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高，脑组织皮质区凋亡神经细胞数显著增加，BDNF表达显著增强，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，尼莫地平组和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组大鼠给药后7、14、28 d神经功能缺损评分均显著降低；给药后28 d脑组织皮质区凋亡神经细胞数显著减少，BDNF表达显著增强，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：舒血通脉胶囊对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能有一定保护作用，其机制可能与增强BDNF表达，抑制神经细胞凋亡有关。

关键词 疏血通脉胶囊；脑缺血再灌注；脑源性神经营养因子；细胞凋亡

中图分类号 R743；R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）16-2184-05

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the neuroprotective effect of Shuxue tongmai （SXTM） capsules on cerebral ischemia- reperfusion injury model rats. METHODS： A total of 36 SD rats were randomly divided into sham operation group （equal volume 0.9% sodium chloride solution）， model group （equal volume 0.9% sodium chloride solution）， nimodipine group （0.01 g/kg）， SXTM capsules low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.32， 0.64， 1.28 g/kg）， with 6 rats in each group. Except for sham operation group， cerebral ischemia reperfusion injury model of rats was established in other 5 groups， and relevant medicine was given intragastrically after modeling，once 2 day， for consecutive 28 d. Neurological function deficit scores were by mNSS method obtained before medication and 3， 7， 14， and 28 d after medication. The cortical neuron apoptosis in cortexarea of rats braintissue was determined by TUNEL method 28 d after medication. The expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in cerebral tissue was determined by immunohistochemical staining mothed. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological function deficit score of model group was increased significantly 7， 14， 28 d after medication. The number of apoptotic cell was increased significantly 28 d after medication， and the expression of BDNF was strengthened significantly，there were significient difference （P<0.01）. Compared with model group， neurological function scores of nimodipine group and SXTM capsules low-dose， medium-dose and high-dose groups were decreased significantly （P<0.01）. The number of apoptotic cell was decreased significantly 28 d after medication （P<0.01）， and the expression of BDNF was strengthened significantly， there were significient difference （P<0.01）. CONCLUSIONS： SXTM capsules has a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting neuronal apoptosis and strengthening the expression of BDNF.

KEYWORDS Shuxue tongmai capsules； Cerebral ischemia-reperfusion； Brain-derived neurotrophic factor； Cell apoptosis

缺血性脑中风是因大脑血液供应受到干扰所造成的脑功能迅速丧失的一种疾病，是造成人类严重残疾和死亡的重要原因之一。脑缺血再灌注的危害极大，其间会产生大量的活性氧和自由基，从而启动一系列机制导致脑细胞凋亡和坏死[1-2]。疏血通脉胶囊是基于广西名中医刘泰教授经验中药方剂经现代工艺程序所制得的胶囊制剂（专利号：2013104694924）[3-4]，该药由三七、薤白、地龙、瓜蒌皮、冰片等药材组合而成，具有化痰熄风、祛瘀通络、痰瘀同治之功，主要用于缺血性脑中风的治疗。前期实验发现，该药可防治血栓的形成及发展，减轻缺血区的炎症反应，改善脑循环，减少神经细胞凋亡[5-6]。但其对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用机制尚不明确。

脑源性神经营养因子（BDNF）作为神经营养因子家族中的一员，由脑组织合成，并广泛分布于中枢神经系统，为感觉神经元、运动神经元及多巴胺神经元提供强大的营养支持，在神经细胞修复和结构重建过程中起重要作用[7-8]。

本研究拟给予大脑中动脉闭塞所致的脑缺血再灌注损伤模型大鼠疏血通脉胶囊进行干预，观察其对模型大鼠神经功能的保护作用，及对模型大鼠脑组织皮质区神经细胞凋亡和BDNF表达的影响，以期进一步揭示其作用机制，为临床合理用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器

IX53型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；EG1150H型生物组织包埋机、ASP200S型组织脱水机、RM2245型石蜡切片机（德国Leica公司）；Image-Pro Plus V6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）。

1.2 药品与试剂

疏血通脉胶囊（广西中医药大学第一附属医院制剂室自制，批号：20160304，规格：0.5 g/粒）；尼莫地平片（亚宝药业集团股份有限公司，批准文号：国药准字H40000119，批号：1411048，规格：20 mg/片）；兔抗大鼠BDNF抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA20140601）；链霉亲和素-生物素复合物（SABC）试剂盒（批号：16151A06，包括二抗、辣根酶标记链酶卵白素工作液）、二氨基联苯胺（DAB）试剂盒（批号：K1552317E）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（河北博海生物开发工程有限公司，批号：161705）；其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

清洁级健康SD大鼠36只，雄性，体质量250～280 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（桂）2014-0002。标准条件饲养，自由进食、饮水，适宜温度、湿度，人工黑暗和光照交替。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将36只SD大鼠随机分为假手术组（等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）、尼莫地平组（0.01 g/kg）和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组（0.32、0.64、1.28 g/kg），每组6只。给药依据：尼莫地平片成人每日剂量为0.1 g/60 kg，根据大鼠药物剂量换算关系表[9]，计算得大鼠的等效剂量为0.01 g/kg；疏血通脉胶囊成人每日剂量为3 g，依上述方法计算得大鼠的等效剂量为0.32 g/kg，疏血通脉胶囊低、中、高剂量组分别为成人等效剂量的1、2、4倍。除假手术组外，其余5组大鼠均以线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型[10]（造模前禁食12 h，不禁水）：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，固定后，取颈部正中切口，钝性分离皮下组织，暴露右侧颈总动脉，分离颈总、颈内、颈外动脉，结扎颈总、颈外动脉。用眼科剪将颈总动脉近分叉处剪一“V”字形切口，将线栓经颈外动脉插入颈内动脉，直到感觉有阻力时停止进线，并将其稍退出1～2 mm，线栓即到达大脑中动脉起始部，進线深度为（18.0±0.5）mm，此时开始记录缺血时间，固定线栓，缝合伤口并消毒。缺血1.5 h后进行再灌注，将线栓拔出，恢复大脑中动脉血供。手术过程中予以照射灯保持大鼠体温在（37.0±0.5）℃，并监测肛温、呼吸和心率。假手术组大鼠线栓插入颈总动脉深度为0.5 mm，其余手术操作相同。以大鼠苏醒后爬行时向左转圈（追尾现象），严重时向左跌倒，提尾时左前肢内收屈曲为造模成功标志。各组大鼠苏醒后开始灌胃相应药物，每天1次，连续28 d。

2.2 神经功能缺损评分

在给药前及给药后3、7、14、28 d，采用改良神经功能评分法（mNSS）对大鼠神经功能缺损进行测评[11]。mNSS评分分为运动、感觉、平衡和反射4个部分，总分为18分，正常大鼠评分为0分；评分越低表示神经功能缺损程度越轻，详见表1。

2.3 神经细胞凋亡检测

采用TUNEL法检测大鼠脑组织皮质区神经细胞凋亡情况。给药后28 d，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg），依次经心脏灌注0.9%氯化钠注射液250 mL和4%多聚甲醛溶液250 mL，断头取脑，置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，然后以常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，自视交叉后方开始连续冠状位切片，厚度5 ?m，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，得石蜡切片，室温保存。石蜡切片经常规脱蜡水化、蛋白酶K室温孵育15 min后，磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.8）漂洗2次（每次5 min），滴加标记液50 μL，37 ℃孵育60 min，PBS漂洗3次（每次2 min），加入过氧化物酶50 μL，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次（每次2 min），DAB显色，苏木精轻度复染细胞核，脱水、透明、封固，于倒置相差显微镜下观察，细胞核呈棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞[12-13]。每只大鼠取4张切片，于每张切片脑梗死侧皮质区随机选定4个不重叠视野（×200）进行凋亡神经细胞计数。

2.4 BDNF表达检测

采用免疫组化法检测脑组织大脑皮质区BDNF表达。取“2.3”项下石蜡切片常规脱蜡、水化、微波热修复，以3%过氧化氢室温孵育5～10 min（以消除内源性过氧化物酶的活性），PBS漂洗3次（每次5 min），滴加正常山羊血清封闭液室温孵育30 min后倾去上清，滴加稀释后的一抗兔抗大鼠BDNF抗体[工作浓度约为1 ∶ 50（V/V）]，4 ℃过夜，经冷PBS漂洗2次（每次5 min）后滴加生物素标记的二抗，室温孵育20 min后滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗3次（每次5 min），DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明、封固，于倒置相差显微镜下观察，细胞浆或细胞核中有棕色颗粒者为阳性细胞。每只大鼠取4张切片，于每张切片脑梗死侧皮质区随机选定4个不重叠视野（×400）进行阳性细胞计数。以表达呈阳性的细胞数代表BDNF表达情况。

2.5 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，两组间数据比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

假手术组大鼠在给药前及给药后3、7、14、28 d的神经功能缺损评分均为0分。与假手术组同期比较，模型组大鼠神经功能缺损评分均显著升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组同期比较，给药后7、14、28 d尼莫地平组和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组大鼠神经功能缺损评分比较见表2。

3.2 各组大鼠脑组织皮质区神经细胞凋亡情况比较

假手术组大鼠脑组织皮质区可见少量凋亡神经细胞。与假手术组比较，模型组大鼠脑组织皮质区凋亡神经细胞数显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药后28 d尼莫地平组和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组大鼠脑组织皮质区凋亡神经细胞数显著减少，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组大鼠脑组织皮质区神经细胞凋亡情况显微图见图1，凋亡神经细胞数比较见表3。

3.3 各组大鼠脑组织皮质区BDNF表达比较

假手术组大鼠脑组织皮质区可见BDNF微弱表达的阳性细胞。与假手术组比较，模型组大鼠脑组织皮质区BDNF表达显著增强，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药后28 d尼莫地平组和疏血通脉胶囊低、中、高剂量组大鼠脑组织皮质区BDNF表达显著增强，差异均有统计学意义（P<0.01）。各组大鼠脑组织皮质区BDNF表达见图2，BDNF表达阳性细胞数比较见表3。

4 讨论

缺血缺氧性脑损伤的直接后果是神经细胞凋亡或不可逆性坏死和超微结构损坏[12]。因此，改善神经细胞的生存环境，抑制缺血缺氧神经细胞的凋亡或坏死，促进原有神经细胞的功能恢复以及诱导分化形成新的神经细胞，可能成为缺血缺氧性脑损伤治疗的重要途径[13]。BDNF是神经生长因子家族成员之一，是在脑内合成的一种蛋白质，广泛存在于中枢神经系统的各个部位，以大脑皮质、海马及纹状体分布最为丰富。BDNF通过与酪氨酸激酶受体的结合激活细胞内信号转导途径，促进中枢神经系统发育过程中特定神经细胞的表达、分化、生长发育及突触可塑性的调节，抑制神经细胞凋亡，改善神经细胞的病理状态，发挥神经保护作用[14-15]。BDNF表达高的区域病理改变轻，有利于损伤神经细胞的修复。造模后大鼠大脑呈缺血的病理状态，脑组织皮质区BDNF与其受体的结合信号转导途径被激活，BDNF表达增强，因此高于假手术组大鼠脑组织皮质区BDNF的表达。

疏血通脉胶囊由三七、薤白、地龙、瓜蒌皮、冰片组成，方中三七、薤白为君药，具有化痰、祛瘀、通络之功效； 地龙、瓜蒌皮为臣药，协同君药加强活血祛瘀作用；冰片为佐使药，具有开窍醒神、清热止痛之功效。全方共奏化痰熄风、祛瘀通络、痰瘀同治、疏血通脉之功效。研究发现，三七重要活性成分三七皂苷可在一定程度上改善模型大鼠脑缺血再灌注损伤状态[16]，机制可能与其能明显上调模型大鼠大脑皮质区中BDNF蛋白表达有关[17]。本研究结果显示，脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织皮质区凋亡神经细胞数显著增加，表现为神经功能障碍。经疏血通脉胶囊干预后，BDNF表达较给药前增强，凋亡细胞数显著减少，大鼠神经功能改善。

综上所述，疏血通脉胶囊能促进脑缺血再灌注后受损神经的修复，改善模型大鼠的神经行为功能。其机制可能与增强BDNF表达，抑制神经细胞凋亡有关。但其具体机制尚有待更进一步的研究阐明。

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（收稿日期：2017-11-03 修回日期：2017-12-21）

（编辑：张 静）