顶空气相色谱法同时测定硫酸沃拉帕沙原料药中7种有机溶剂的残留量

刘英 刘葵葵 邓玉晓 孙德清

摘 要 目的：建立同时测定硫酸沃拉帕沙原料药中7种有机溶剂残留量的方法。方法：采用顶空气相色谱法。色谱柱为Agilent DB-624毛细管柱，程序升温，进样口温度为220 ℃，检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为250 ℃，载气为氮气（纯度：99.999%），流速为2.0 mL/min，分流比为20 ∶ 1，顶空进样量为1 mL，顶空平衡温度为80 ℃，顶空平衡时间为30 min。结果：乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯检测质量浓度线性范围分别为2.0～201.0 μg/mL（r=0.999 8）、1.2～122.3 μg/mL（r=0.999 4）、0.24～24.0 μg/mL（r=0.999 2）、2.0～200.3 μg/mL（r=0.999 9）、0.2～16.7 μg/mL（r=0.999 9）、0.3～29.0 μg/mL（r=0.999 3）、0.4～35.8 μg/mL（r=0.999 3）；定量限分別为2.0、1.2、0.24、2.0、0.2、0.3、0.4 μg/mL，检出限分别为0.60、0.30、0.07、0.60、0.06、0.09、0.12 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于4%；加样回收率分别为97.02%～99.84%（RSD=0.88%，n=9）、98.05%～99.64%（RSD=0.54%，n=9）、97.37%～100.00%（RSD=0.83%，n=9）、98.67%～99.60%（RSD=0.34%，n=9）、 97.56%～99.76%（RSD=0.79%，n=9）、97.22%～99.45%（RSD=0.65%，n=9）、97.75%～99.33%（RSD=0.59%，n=9）；耐用性试验的RSD均小于8%。原料药样品中仅检出甲醇、乙醇。结论：该方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于硫酸沃拉帕沙原料药中7种有机溶剂残留量的同时测定。

关键词 顶空气相色谱法；硫酸沃拉帕沙；残留溶剂

中图分类号 R927.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）16-2224-04

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish simultaneous determination of 7 kinds of residual solvents in vorapaxar sulfate raw material. METHODS： The headspace gas chromatography was performed on Agilent DB-624 capillary column（programmed temperature） with inlet temperature of 220 ℃， detection temperature of 250 ℃ using nitrogen（99.999%） as carrier gas at the flow rate of 2.0 mL/min. The split ratio was 20 ∶ 1， and sample size was 1 mL. The headspace equilibrium temperature was 80 ℃，headspace equilibrium time was 30 min. RESULTS： The linear range of ethyl acetate， methanol， dichloromethane， ethanol， acetonitrile， tetrahydrofuran and toluene were 2.0-201.0 μg/mL（r=0.999 8）， 1.2-122.3 μg/mL（r=0.999 4）， 0.24-24.0 μg/mL（r=0.999 2）， 2.0-200.3 μg/mL（r=0.999 9）， 0.2-16.7 μg/mL（r=0.999 9）， 0.3-29.0 μg/mL（r=0.999 3）， 0.4-35.8 μg/mL（r=0.999 3）， respectively. The limits of quantification were 2.0， 1.2， 0.24， 2.0， 0.2， 0.3， 0.4 μg/mL； the limits of detection were 0.60， 0.30， 0.07， 0.60， 0.06， 0.09， 0.12 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 4%. The recoveries were 97.02%-99.84%（RSD=0.88%，n=9）， 98.05%-99.64%（RSD=0.54%，n=9）， 97.37%-100.00%（RSD=0.83%，n=9）， 98.67%-99.60%（RSD=0.34%，n=9）， 97.56%-99.76%（RSD=0.79%，n=9）， 97.22%-99.45%（RSD=0.65%，n=9）， 97.75%-99.33%（RSD=0.59%，n=9）， respectively. RSDs of durability tests were all lower than 8%. Methanol， ethanol were detected in samples. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable， and can be used for simultaneous determination of 7 kinds of residual solvents in vorapaxar sulfate raw material.

KEYWORDS Headspace gas chromatography； Vorapaxar sulfate； Residual solvents

硫酸沃拉帕沙（Vorapaxar sulfate）是一种可逆性蛋白酶激活受体1（PAR-1）拮抗药，能够选择性地阻断凝血酶介导的血小板激活通路，同时，不影响二磷酸腺苷、胶原、血栓烷介导的血小板聚集，达到既抑制血栓形成又保留生理性止血能力的目的，较其他传统抗血小板药物有较大优势[1-4]。临床上，硫酸沃拉帕沙主要用于有心肌梗死和外周动脉栓塞病史的患者，以降低其血栓性心血管事件的发生率[5-6]。2014年5月8日，硫酸沃拉帕沙获美国FDA批准上市，商品名Zontivity[2，7]。目前2015年版《中国药典》、《歐洲药典》（9.0版）、《日本药典》（16版）与《美国药典》（40版）均未收载该药。已有文献报道了硫酸沃拉帕沙片的溶出度测定方法[8]，但尚未见有关于硫酸沃拉帕沙原料药中有机溶剂残留量测定的报道。硫酸沃拉帕沙后5步合成工艺中分别使用了乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃和甲苯等有机溶剂。为确保药品的安全、有效和质量可控，根据2015年版《中国药典》（四部）[9]的相关规定和人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指导原则[10-11]的相关要求，应增加有机溶剂的考察。因此，笔者对硫酸沃拉帕沙原料药中7种有机溶剂的残留量进行了同时测定，以完善其药品质量检测项目。

1 材料

1.1 仪器

7890N型气相色谱仪，包含氢火焰离子化检测器（FID）、7697A顶空自动进样器等（美国Agilent公司）；BS 210S型十万分之一电子分析天平（德国Sartorius公司）；ZUPT-I-20T型纯水机（台湾艾柯电子有限公司）。

1.2 药品与试剂

硫酸沃拉帕沙原料药[山东省化学药物重点实验室自制，批号：20171001（纯度：99.8%）、20171002（纯度：99.7%）、20171003（纯度：99.8%）]； 乙酸乙酯对照品（批号：20161106，纯度：99.7%）、甲醇对照品（批号：20170206，纯度：99.8%）、二氯甲烷对照品（批号：20170310，纯度：99.5%）、乙醇对照品（批号：20161208，纯度：99.8%）、乙腈对照品（批号：20170808，纯度：99.8%）、四氢呋喃对照品（批号：20160912，纯度：99.8%）、甲苯对照品（批号：20170502，纯度：99.6%）均购自国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624毛细管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；升温程序：初始温度为40 ℃，保持8 min，以25 ℃/min的速度升温至160 ℃，保持2 min；进样口温度：220 ℃；检测器：FID；检测器温度：250 ℃；载气：氮气（纯度：99.999%）；流速：2.0 mL/min；分流比：20 ∶ 1；顶空进样量：1 mL；顶空瓶装样量：5 mL；顶空平衡温度：80 ℃；顶空平衡时间：30 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别称取各待测成分对照品适量，置于同一100 mL量瓶中，加DMF溶解并定容，摇匀，制成乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃、甲苯质量浓度分别为500、300、60、500、41、72、89 μg/mL的混合对照品贮备液。精密量取上述混合对照品贮备液5 mL，置于50 mL量瓶中，加DMF定容，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密称取原料药样品0.5 g，置于顶空瓶中，精密加入DMF 5 mL，密封，振摇使溶解，即得。

2.2.3 空白对照溶液 精密量取DMF 5 mL作为空白对照溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下空白对照溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。结果，理论板数以甲醇峰计为39 548；各待测成分峰分离度均大于2。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品贮备液0.1、0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置于25 mL量瓶中，加DMF定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各5 mL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检出限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检出限。结果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃和甲苯的定量限分别为2.0、1.2、0.24、2.0、0.2、0.3、0.4 μg/mL，检出限分别为0.60、0.30、0.07、0.60、0.06、0.09、0.12 μg/mL。

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃和甲苯峰面积的RSD分别为2.4%、3.6%、3.7%、2.8%、3.3%、2.9%、2.8%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20171001）适量，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”项下混合对照品贮备液1.0 mL，加DMF定容，摇匀，分别于室温下放置0、2、4、6、8 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氢呋喃和甲苯峰面积的RSD分别为3.2%、3.8%、2.9%、3.4%、2.7%、2.8%、3.1%（n=5），表明供试品溶液在室温下放置8 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取原料药样品（批号：20171001）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品残留量。结果，乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲苯均未检出；甲醇和乙醇残留量平均值分别为0.01%、0.06%，RSD分别为2.8%、1.9%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知残留量原料药样品（批号：20171001）适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的各待测成分对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察 精密称取原料药样品（批号：20171002）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件[分别设置色谱柱为DB-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）、AT-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）、 CP-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）]进样测定，记录峰面积并计算样品残留量，结果见表3。结果表明，色谱柱发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，提示耐用性良好。

2.10.2 顶空平衡温度考察 精密称取原料药样品（批号：20171002）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置顶空温度为79、80、81 ℃）进样测定，记录峰面积并计算样品残留量，结果见表3。结果表明，顶空平衡温度发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，提示耐用性良好。

2.10.3 流速考察 精密称取原料药样品（批号：20171003）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件（分别设置流速为1.9、2.0、2.1 mL/min）进样测定，记录峰面积并计算样品残留量，结果见表3。结果表明，流速发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，提示耐用性良好。

2.10.4 柱温（初始温度）考察 精密称取原料药样品（批号：20171003）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件[分别设置柱温（初始温度）为39、40、41 ℃]进样测定，记录峰面积并计算样品残留量，结果见表3。结果表明，柱温（初始温度）发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，提示耐用性良好。

2.11 样品残留量测定

取3批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并以外标法计算7种有机溶剂的残留量，结果见表4。

3 讨论

3.1 进样方式的选择

本试验待测成分均为低沸点溶剂，虽然直接进样相比顶空进样操作简单，但是待测样品在高温条件下可能分解出挥发性产物干扰测定结果，故本试验采用顶空进样方式[11-12]。

3.2 色谱柱的选择

笔者前期分别选择了不同极性的毛细管柱进行试验，如DB-1701、HP-1、HP-5、DB-624。结果，采用HP-1柱进样测定时，甲醇、二氯甲烷与乙醇峰不能完全分离；采用DB-1701、HP-5柱进样测定时，乙酸乙酯与甲醇峰不能完全分离；而采用DB-624柱进样测定时，各待测成分峰之间的分离度均符合要求[13]。因此，选择DB-624为本试验的色谱柱。

3.3 溶剂的选择

顶空气相色谱法常用溶剂为水、DMF、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亚砜。硫酸沃拉帕沙的水溶性较差，因此不可以水为溶剂。经考察硫酸沃拉帕沙在DMF中溶解性良好，且DMF在各待测成分之后出峰，对测定结果无干扰，故本试验选用DMF作为溶剂。

综上所述，本方法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性、耐用性好，可用于硫酸沃拉帕沙原料药中7种有机溶剂残留量的同时测定。

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（收稿日期：2017-10-11 修回日期：2018-02-15）

（编辑：张 静）