Th17及Treg在卵巢癌中的表达及其临床意义研究

孙孟雄 杨 丽 王娟娟 胡亚丽 李芙琴

辅助性T细胞17(T help cell 17，Th17)属于T淋巴细胞及亚群CD4+T。作为CD4+T细胞亚群，高水平地分泌白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)，被命名为Th17细胞[1]。调节性T细胞(Treg)是一组具有维持自身免疫耐受功能的CD4+T细胞亚群，该类细胞的数量和功能障碍可使其对效应T细胞的抑制功能减弱，从而导致机体外周免疫的失衡[2]。Th17细胞被普遍认为是一群介导炎性反应的重要细胞[3-5]。而国内外学者研究证实Treg细胞在卵巢癌患者体内数量、功能异常，可能与卵巢癌的发生发展有关[6-8]。Th17与Treg均属于CD4+T细胞亚群，具有一定的可塑性，通过细胞因子相互影响、制约维持动态平衡。在分化及功能上Th17/Treg是一对相互制约的平衡体系，维持着机体的免疫稳定，一旦平衡打破，机体会发生免疫功能失常，导致疾病的发生，如炎症、肿瘤及免疫性疾病等[9-10]。

卵巢癌是一种常见的易发于女性生殖系统的恶性肿瘤，其发病率低于宫颈癌和宫体癌，但因为卵巢癌发病隐匿，绝大多数患者无明显临床症状，导致其普查和早期诊断缺乏，所以70%以上患者就诊时已至晚期，治疗和预后效果很差，致死率占各类妇科肿瘤的首位[11]。目前卵巢癌的发病机制依然未研究透彻，可能与女性外源性激素、月经、妊娠及哺乳、病毒感染、饮食、遗传因素、癌基因与抑癌基因、精神因素等多方面因素有关[12]。截止目前，欧美公认的卵巢癌的肿瘤标志物只有糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)[13]。因此，亟需找到一种与CA125同样符合卵巢癌肿瘤标志性的指标，本研究通过流式细胞仪检测各期卵巢癌患者外周血中的Th17细胞与Treg细胞，并结合患者CA125结果进行相关性分析，期望得到在卵巢癌发病过程中Th17/Treg平衡状态改变对卵巢癌发病可能发挥的作用，并研究Th17/Treg与CA125的相关性，以期能找到另一个卵巢癌肿瘤标志性指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2017年6月在张家口市第一医院妇科住院医治的45例卵巢癌患者，将其纳入卵巢癌组，年龄31～75岁，平均年龄(45.14±17.29)岁，所有病例均经病理证实为上皮性卵巢癌。按照国际妇产科联合会(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2000年手术-病理分期标准，Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期18例，Ⅳ期13例。所有病例排除自身免疫性疾病、感染及严重的心肝肾疾病，采集样本前未进行免疫治疗、手术及化疗。同期选取45名女性健康体检者为正常对照，并将其纳入健康对照组。该研究取得医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

(1)仪器。采用FASCCanto型流式细胞仪(美国BD公司)；Advia Centaur型全自动化学发光仪(美国Bayer公司)。

(2)试剂。鞘液ISOTON Ⅲ血细胞稀释液(美国Backman Coulter公司)；改良型RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute1640 洛斯维1604培养基)(北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司)；氟波酯(phorbol ester，PMA)、离子霉素(Ionomycin)及布雷杆氏菌素A(brefeldinA，BFA)(美国Sigma公司)；破膜剂(美国Invitrogen公司)；IL-17A-FITC(美国eBioscience公司)；CD25-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC单克隆抗体(美国Beckman coulter immunotech)；CAl25检测使用Advia Centaur全自动化学发光仪。

1.3 标本收集与细胞刺激和培养

(1)卵巢癌组患者均自入院第2 d清晨，空腹平卧位采集肘静脉血5 ml两管；健康对照组为体检女性，亦空腹采集肘静脉血5 ml两管，1管肝素钠采集，1管普通管采集。

(2)取采集到的血液样本100 μL，加入100 μL RPMI1640培养液混匀，再加入5 μL PMA工作液，5 μL Ionomycin工作液，40 μL BFA工作液，体系中PMA、Ionomycin、BFA终浓度分别为25 μg/L、1.0 g/L和1.7 g/L。在37 ℃，5%CO2培养箱中刺激培养5 h，取出细胞进行标记。

1.4 检测方法

(1)Th17、Treg细胞标记及频数检测。取100 μl经刺激培养的全血细胞，加入10 μl CD4-FITC单克隆抗体，室温避光孵育15 min。100 μl固定液(A液)室温避光固定反应15 min，加入3 ml PBS，混匀离心弃上清。加入100 μl破膜剂(B液)进行细胞打孔利于细胞因子染色，加入IL-17A-FITC 20 μl，室温避光孵育20 min后，加入3 ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)，静置10 min，离心弃上清，再加入0.5 ml PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测。根据CD4设门圈定T淋巴细胞群，分析CD4+-17A+T细胞。

(2)CD4+CD25+T细胞检测。取100 μL经刺激培养的全血细胞，加入CD25-PerCP-Cy5.5抗体、CD4-FITC抗体各5 μl，设同型对照管，室温暗室孵育20 min后，加入红细胞破膜剂100 μl进行细胞打孔利于细胞因子染色，室温暗室孵育10 min。洗涤后，用磷酸盐缓冲液500 μl重悬细胞，于24 h内流式细胞仪检测，根据CD4设门圈定T淋巴细胞群，结果即为CD4+CD25+T细胞。

(3)CA125检测。经由同位素科进行检测，在美国Bayer公司Advia Centaur全自动化学发光仪上测定。

1.5 观察与评价指标

比较两组外周血中Th17、Treg与Th17/Treg细胞频数；比较卵巢癌组患者分期外周血中Th17、Treg与Th17/Treg细胞频数；同时比较卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17与Treg细胞频数。

1.6 统计学方法

对两组数据资料使用SPSS 19.0统计学软件分析、处理，所得数值均采用均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验，方差不齐时采用Wilcoxon秩和检验，相关性分析采用Pearson分析，相关系数用r表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血中Th17、Treg与Th17/Treg细胞频数比较

(1)检测结果显示，卵巢癌组外周血中Th17细胞表达频率为(2.98±0.67)%，健康对照组外周血表达频率为(1.57±0.50)%，卵巢癌组Th17细胞表达频率显著高于健康对照组，差异有统计学意义(t=11.16，P＜0.01)，如图1所示。

图1 流式细胞仪检测Th17细胞表达频率示图

(2)卵巢癌组外周血T r e g细胞表达频率为(15.37±2.34)%，健康对照组外周血表达频率为(5.49±1.26)%，卵巢癌组Treg细胞表达频率显著高于健康对照组，差异有统计学意义(t=24.95，P＜0.01)，如图2所示。

图2 流式细胞仪检测Treg细胞表达频率示图

(3)在Th17/Treg中卵巢癌组与健康对照组比较差异亦有统计学意义(t=17.14，P＜0.01)，见表1。

表1两组外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg细胞表达率(%，±s)

表1两组外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg细胞表达率(%，±s)

组别 例数 Th17细胞 Treg细胞 Th17/Treg卵巢癌组 45 2.98±0.67 15.37±2.34 19.10±1.50健康对照组 45 1.57±0.50 5.49±1.26 27.97±3.13 t值 11.16 24.95 17.14 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 卵巢癌组患者分期外周血中Th17、Treg与Th17/Treg细胞频数比较

在卵巢癌分期中可见Th17与Treg细胞在Ⅰ～Ⅱ与Ⅲ～IV期间差异均有统计学意义(t=4.62，t=7.811；P＜0.01)，但Th17/Treg在分期中无显著差异(t=0.654，P＞0.05)，见表2。

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg与Th17/Treg细胞与卵巢癌TNM分期特征关系(±s)

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg与Th17/Treg细胞与卵巢癌TNM分期特征关系(±s)

细胞(%) 例数 TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(14例) Ⅲ～Ⅳ(31例)Th17 2.40±0.59 3.23±0.54 4.62 ＜0.01 Treg 12.73±1.06 16.56±1.68 7.811 ＜0.01 Th17/Treg 18.78±3.81 19.75±4.23 0.654 0.53

2.3 卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17与Treg细胞频数比较

在45例卵巢癌患者中有6例检测CA125结果未收集到，因此分析39例卵巢癌患者的CA125检测数据，此间CA125、Th17与Treg细胞在卵巢癌分期中比较差异均有统计学意义(t=4.873，t=7.947，t=9.114；P＜0.01)，见表3。

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17与Treg细胞与卵巢癌分期特征关系(±s)

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17与Treg细胞与卵巢癌分期特征关系(±s)

细胞(%) TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(13例) Ⅲ～Ⅳ(26例)Th17 2.43±0.60 3.28±0.55 4.873 ＜0.01 Treg 12.86±0.99 16.88±1.65 7.947 ＜0.01 CA125 74.76±30.15 380±170.38 9.114 ＜0.01

2.4 卵巢癌组患者外周血中CA125与Th17、Treg、Th17/Treg细胞相关性

卵巢癌组患者外周血中CA125与Th17、Treg、Th17/Treg细胞相关性分析。在卵巢癌患者外周血检测中，CA125与Th17、Treg及Th17/Treg细胞呈正相关(r=0.656，r=0.749，r=0.358；P＜0.05)，见表4。

表4卵巢癌患者外周血CA125与Th17、Treg及Th17/Treg细胞相关性分析

3 讨论

Th17细胞属于CD4+T细胞群的一组细胞亚群，会在多种免疫性疾病中呈现多克隆和过度激活状态，其主要分泌IL-17A、IL-17F和肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞因子，正是这些炎症介质参与介导免疫细胞在局部组织中的浸润。多项研究论证了Th17细胞及其分泌的主要细胞因子IL-17A参与了多种自身免疫性疾病的病理生理过程[14-18]。有国外研究者发现，卵巢癌患者的肿瘤组织中Th17细胞的数量与卵巢癌疾病分级有关[19]。王丽华等[20]在卵巢癌外周血液Th17细胞频数研究中发现，CD3+CD4+-17A+细胞频数百分率增多，与临床分期相关，与细胞分化与组织类型无关。Treg细胞主要发挥免疫抑制作用，与许多肿瘤的发生呈正相关，包括乳腺癌、宫颈癌等，外周血中Treg细胞的百分率升高与肿瘤的分期、大小及淋巴转移呈正相关[21-22]。在本研究中发现Th17细胞与Treg细胞频数的增加均与卵巢癌的发生有关，且Th17/Treg在病例组中明显低于对照组，可从侧面显示在卵巢癌发生发展过程中Treg的增长要多于Th17的增长，但这个比值在卵巢癌分期中并无明显的差异。

在卵巢癌患者外周血CA125与Th17、Treg、Th17/Treg细胞的分析中可以发现，CA125在卵巢癌分期中有显著差异，而且在对这几个指标进行相关性分析时发现，CA125与其他指标都存在着正相关性。截止目前，欧美公认的卵巢癌的肿瘤标志物只有CA125，在国内一般也是最多使用CA125或CA125与其他肿瘤标志物共同评估与先期诊断[23-25]。本研究的相关性结果可以从一方面显示Th17、Treg、Th17/Treg指标与CA125有较强的相关性，有可能成为与CA125联合诊断卵巢癌的一种指标。

卵巢癌患者外周血中Th17与Treg细胞数量比正常人体内显著增多，其参与了卵巢癌的发生及发展过程。进一步研究其在卵巢癌发病的不同时期的变化，将有助于全面了解卵巢癌患者机体的免疫状态，为卵巢癌的免疫治疗提供理论支持。本研究发现，CA125与Th17、Treg、Th17/Treg呈正相关，可以从一方面显示Th17、Treg及Th17/Treg的增高与CA125的增高速度类似，有可能与其他指标结合，评估或诊断卵巢癌，但因本研究案例较少，所以要得出准确的结果还需待以后研究。