耐低氮假俭草种质筛选

李丹丹,宗俊勤,陈静波,郭海林,汪 毅,刘建秀

(江苏省中国科学院植物研究所,江苏 南京 210014)

氮是草坪草生长发育需要量最多的营养元素[1]。合理施用氮肥可明显改善草坪色泽,提高草坪质量[2],增加草坪密度,增强草坪抗性和提高草坪恢复能力[3]。但在实际生产应用中，由于缺乏合理的养分管理措施和技术指导，过量施用氮肥的现象非常普遍。氮肥施用过多一方面提高了草坪的养护成本，另一方面过量的氮素通过淋洗、径流、反硝化气态损失而浪费掉，会对土壤、水体等产生不良的环境影响[4-6]。Christopher等[7]对澳大利亚本土的草坪草种质资源进行评价，发现不同种质间对氮素的吸收利用存在很大变异。我国本土具有丰富的草坪草种质资源，这些种质对氮的吸收利用也可能存在显著变异。而利用草坪草自身对氮素吸收利用的遗传性差异，选育低氮营养下氮高效的草坪草种质资源对提高氮素利用效率和保护环境具有重要意义。

假俭草(Eremochloaophiuroides)是禾本科黍亚科蜈蚣草属植物，是该属中唯一可以用作草坪草的多年生草本植物[8]，除在东南亚有少量分布外，主要分布在我国长江流域及其以南地区，被称为“中国草坪草”[9]。假俭草叶形优美，植株低矮，生长缓慢，具有耐阴、抗病、抗虫、耐瘠薄等优良特性，可用作庭院草坪、园林绿化及保土护坡草坪，具有广阔的开发应用前景[10-11]。1916年Frank Meyer从我国西南把假俭草引进美国，假俭草在美国备受重视，育出了‘Common’、 ‘TC319’、‘Oklawn’ 、‘Aucentennial’和‘TifBlair’等假俭草品种[12]，并针对假俭草抗逆性、遗传多样性、育种和草坪建植等方面进行了一系列研究[13]。我国对假俭草的研究起步较晚，国内许多学者就施肥对假俭草的影响开展了一定的研究。如，以峨眉假俭草为试验材料，进行假俭草的施肥试验，发现叶片施氮、铁肥可以改善草坪的绿度，增加假俭草的抗寒性，延缓衰老，促进返青，从而延长假俭草草坪的青绿期[14]； 以假俭草为材料进行盆栽试验，发现硝酸钾可以提高叶绿素含量、脯氨酸含量，提高抗寒性[15]施肥对草坪生长影响的相关研究已经在狗牙根(Cynodondactylon)[16]、结缕草(Zoysiajaponica)[17]、高羊茅(Festucaarundinacea)[18]、黑麦草(Loliumperenne)[19]、常用禾草[20]中开展，各种研究结果表明，不同种属植物材料对氮的需求存在显著差异。但是，关于假俭草耐低氮营养的种质资源多样性研究还鲜见报道。

江苏省中国科学院植物研究所多年来收集引种假俭草种质资源共计200余份，并在此基础上对假俭草种质资源的生长发育特性、形态解剖特征、物候性和抗逆性进行了系统研究[21-22]。本研究以前期研究得到的坪用价值较高假俭草优良种质为材料，通过水培试验研究假俭草不同种质间耐低氮的差异，并从中筛选出最耐低氮的假俭草种质，从而为假俭草耐低氮种质的遗传改良和养护管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

以坪用价值较高的10个假俭草优良种质为试验材料(表1)，进行水培试验，所有材料均取自江苏省中国科学院植物研究所草业中心试验地(32°02′ N，118°28′ E)。试验方法和日常管理参考陈静波等[23]并略作修改。假俭草返青后，从试验地取生长均匀一致、直径7 cm的草皮块，用自来水冲洗干净后，种植于装有干净河沙的塑料杯中(直径7 cm、深10 cm)，放于温室内进行预培养。营养液pH在6左右，采用修改了的Hoagland营养液[0.4 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、1.6 mmol·L-1KNO3、0.5 mmol·L-1(NH4)2SO4、1 mmol·L-1KH2PO4、1 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.5 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1Fe-EDTA、2.35 mmol·L-1H3BO3、0.55 μmol·L-1MnSO4·H2O、0.038 5 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.016 5 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.006 5 μmol·L-1H2MoO4]。低氮水平下采用CaSO4代替Ca(NO3)2，K2SO4代替KNO3。用电动气泵持续通气，每7 d更换一次营养液。每天检查箱内水位,并用去离子水补充由于液面蒸发和植物吸收及蒸腾而损失的水分,同时用0.1 mmol·L-1的HCl和0.1 mmol·L-1的NaOH调pH至5.5～6.5。

为使假俭草适应水培环境,使其生长一致，减少同一材料间的生长差异，处理前进行1个月左右的预培养。为保证试验材料的一致性，处理前1 d统一修剪, 修剪高度为5 cm。前期做氮浓度梯度试验(0.05、0.5、1、2.5、5、10、20、40mmol·L-1)，通过研究假俭草植株生长和生理指标发现，5 mmol·L-1氮水平地上部密度最大，不同指标变异系数最小，确定为最适氮水平，0.05 mmol·L-1氮水平下不同假俭草种质差异最显著，因此设2个氮水平[5 mmol·L-1(对照)和0.05 mmol·L-1(低氮)]，随机区组设计，重复3次。处理期间每7 d修剪一次，修剪材料105 ℃杀青后，80 ℃烘干至恒重后称重。处理4周后取样，测定形态数据，分为残茬和根系，烘干后称重。

表1 供试假俭草种质的来源Table 1 Germplasm and source of centipedegrass used in this experiment

1.2 形态数据测定

草层高度：处理结束用直尺测量每杯材料的自然高度，重复3次，求平均值。叶片长度和宽度：每个处理随机抽取顶部倒数第2张完全展开叶片5张，用游标卡尺测定其长度和宽度，求平均值。

1.3 氮含量测定

烘干后植株样磨成粉末，全氮含量采用凯氏定氮法[24]测定。

1.4 数据统计

为了消除不同假俭草种质间固有的生物学特性和遗传学特性的差异，采用耐低氮指数[25]指标来衡量不同种质间的耐低氮差异。

耐低氮指数=低氮胁迫下的测定值/正常氮水平下的测定值。

采用数据分析软件SPSS 19.0，分别对不同氮水平、不同种质进行单因素方差分析；以14个氮含量和氮积累量相关生长指标的耐性指数为依据，经归一化处理后采用离差平方和法对假俭草不同种质进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 低氮对假俭草生长和生理特性的影响

低氮处理降低了假俭草草层高度、叶长和叶宽，与对照相比，修剪枝叶干重、残茬干重降低，而根干重增加，但差异不显著(P>0.05)，因此总干重降低(表2)。方差分析表明，除根干重外，其余6个生长指标对假俭草生长的影响均达到显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。

表2 低氮对假俭草生长的影响Table 2 Effect of low-nitrogen supply on the growth of centipedegrass

同列不同小写字母表示不同氮水平之间差异显著(P<0.05)；*和**分别表示在0.01和0.05水平上影响显著。 下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different nitrogen levels at the 0.05 level; * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively; similarly for the following tables.

方差分析表明，7个生长指标不同种质间差异均达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)(表3)。7个生长指标变异系数均大于10%，其中，相对残茬干重变异系数最大，为44.84%，变异系数最小的是相对叶宽，为11.91%。不同种质间比较，除相对叶长和相对枝叶修剪干重外，其余5个指标的耐性指数E-126均为最高；除相对残茬干重外，其余6个指标的耐性指数以Tifblair均为最低。

2.2 低氮对假俭草氮含量和氮积累量的影响

与对照相比，低氮处理降低了假俭草修剪枝叶、残茬和根系的氮含量和氮积累量，以及总氮积累量(表4)。方差分析表明，除修剪枝叶氮积累量外，其余6个氮含量和氮积累量相关指标不同氮水平之间的差异均达到极显著水平(P<0.01)。

方差分析表明，修剪枝叶、残茬、根系相对氮含量，修剪枝叶、残茬、根系和总氮相对积累量不同种质间差异均达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)(表5)。修剪枝叶、残茬、根系相对氮含量，修剪枝叶、残茬、根系和总氮相对积累量均具有较大变异(变异系数>10%)。其中，残茬相对氮积累量变异系数最大，为51.08%，变异系数最小的是残茬相对氮含量，为16.29%。不同种质间比较，除根系相对氮含量和修剪枝叶相对氮积累量外，其余5个指标的耐性指数E-126均为最高；除残茬和根系相对氮含量外，其余5个指标的耐性指数Tifblair均为最低。

2.3 假俭草耐低氮种质资源筛选

以14个氮含量和氮积累量相关生长指标的耐性指数为依据，经归一化处理后采用离差平方和法进行聚类分析(图1)。以欧氏距离10为标准可以将10个假俭草种质资源聚成3类(耐低氮型、中间型、低氮敏)感型，其中耐低氮型种质为E-126和E-039，低氮敏感型种质为E-038和Tifblair，中间型种质为Common、E-022、E-092(1)、翠绿1号、E-099和E-174。

表3 低氮处理对不同假俭草种质生长指标耐性指数的影响Table 3 Variation in the relative values of growth traits of different centipedegrass accessions in response to low-nitrogen supply

表4 低氮对假俭草氮含量和氮积累量的影响Table 4 Effect of low-nitrogen supply on nitrogen content and accumulation in centipedegrass

表5 低氮对不同种质假俭草氮含量和氮积累量耐性指数的影响Table 5 Variation in the relative values of nitrogen content and accumulation traits of different centipedegrass accessions in response to low-nitrogen supply

图1 10个假俭草种质资源的系统聚类图Fig. 1 System clustering of 10 centipedegrass accessions

3个类群相对草层高度、相对叶长、相对叶宽、修剪枝叶相对干重、残茬相对干重、相对根干重和相对总干重差异均达到极显著水平(P<0.01)(表6)。不同类群间比较，耐低氮型除相对叶长外，其余6个生长指标的耐性指数均显著高于中间型和低氮敏感型(P<0.05)；耐低氮型残茬相对干重和相对根干重均大于1，说明低氮促进了耐低氮型假俭草残茬和根系的生长。低氮敏感型的相对草层高度、相对叶宽、修剪枝叶相对干重、相对残茬干重、相对根干重和相对总干重仅为耐低氮型的78.57%、62.75%、49.41%、55.36%、55.56%和55.56%，说明低氮敏感型假俭草生长受到低氮的明显抑制。

除残茬相对氮含量和根系相对氮积累量外，3个类群其余5个氮含量和氮积累量相关指标耐性指数的差异均达到显著(P<0.05)或极显著水平P<0.01)(表7)。不同类群间比较，除残茬相对氮含量、根系相对氮含量和根系相对氮积累量外，耐低氮型其余5个氮含量和氮积累量相关指标均显著高于中间型和低氮敏感型，说明耐低氮型通过提高修剪枝叶氮含量，并在修剪枝叶和残茬累积更多的氮适应低氮营养。低氮敏感型7个氮含量和氮积累量相关指标的耐性指数显著低于耐低氮型和中间型。

3 讨论

3.1 低氮对假俭草生长、氮含量和氮积累量的影响

植物耐低氮的研究开始于20世纪30年代。到目前为止，在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麦(Triticumaestivum)、燕麦(Avenasativa)、棉花(Gossypiumspp.)、高粱(Sorghumbicolor)、马铃薯(Solanumtuberosum)、黑麦草、狗牙根等植物上均有这方面的报道[16,19,26-28]。有研究表明，低氮通常导致地上部生长减缓，营养物质更多的分配到根系中[29]。苏日古嘎等[20]研究了介质供氮水平对10种禾草幼苗生长及氮效率的影响，发现在低氮培养介质中, 禾草各器官的生长发育都受到抑制, 不同禾草冠层特性变化受到的影响程度不同。本研究结果表明，低氮降低了假俭草草层高度、叶长、叶宽、修剪枝叶和残茬干重，而根干重与对照相比差异不显著；低氮降低了修剪枝叶、残茬和根系的氮含量和氮积累量。此外，与对照比较，低氮条件下根系氮积累量降低幅度明显小于修剪枝叶和残茬的氮积累量。综上，低氮条件下，假俭草通过减缓地上部生长，分配更多氮给根系以维持根系的正常生长来获取更多氮素。

表6 不同类群生长耐性指数的差异Table 6 Differences in the relative values of growth indices among the three accession clusters

表7 不同类群氮含量和氮积累量耐性指数的差异Table 7 Differences in the relative values of nitrogen content and accumulation among the three accession clusters

3.2 假俭草耐低氮的种质资源多样性

假俭草外部性状、种子产量[9,21]、坪用价值[30]、物候期[22]等方面存在显著差异，但是有关假俭草种质资源耐低氮差异方面还未有深入研究。低氮介质培养条件下, 不同禾草生长和生理学特性变化受到的影响程度不同[20]。本研究结果表明，假俭草7个生长指标和7个氮含量和氮积累量相关指标耐性指数变异系数均大于10%，说明低氮处理条件下不同假俭草种质间生长、氮含量和氮积累量存在显著差异。不同种质间比较，除相对叶长、相对枝叶修剪干重、相对根系氮含量和相对枝叶氮积累量外，其余10个指标的耐性指数E-126均为最高，说明E-126最耐低氮。对氮肥提高假俭草抗寒性研究发现，施用氮肥可延长E-126青绿期12～13 d，说明该材料自身耐低氮的优良特性有助于提高青绿期[15]。本研究中，除相对残茬干重、相对残茬氮含量和相对根系氮含量外，其余11个指标的耐性指数Tifblair均为最低，说明Tifblair对低氮最敏感。TifBlair为美国引进种质，说明该材料不适应中国本土野外生长环境，需要适当施氮才能保持正常生长。

3.3 不同类群假俭草耐低氮的差异

以7个生长指标和7个氮含量和氮积累量相关指标的耐性指数为筛选指标，通过聚类分析将10个种质资源分为3类(耐低氮型、中间型、低氮敏感型)。3个类群的7个生长指标和7个氮含量和氮积累量相关指标耐性指数的平均值呈递减趋势。除相对叶长、相对残茬氮含量、相对根系氮积累量外，3个类群之间其余11个生长，氮含量和氮积累量相关的耐性指数平均值差异均达到极显著水平(P<0.01)。不同类群间比较，耐低氮型除相对叶长、相对残茬氮含量、相对根系氮含量和相对根系氮积累量外，其余10个生长和生理指标的耐性指数均显著高于中间型和低氮敏感型；耐低氮型相对残茬干重和相对根干重均大于1，相对残茬氮积累量和相对根氮积累量显著高于低氮敏感型和中间型，说明耐低氮型假俭草通过分配更多氮给残茬和根系以促进残茬和根系的生长来适应低氮营养。低氮敏感型7个生长指标和7个氮含量和氮积累量相关指标的耐性指数均显著小于中间型和耐低氮型，说明低氮敏感型假俭草生长受到低氮的明显抑制。

4 结论

低氮处理条件下，假俭草地上部生长降低，将更多氮分配给根系以维持根系的正常生长。且不同假俭草种质间生长、氮含量和氮积累量存在显著差异。进一步通过对7个生长指标和7个氮含量和氮积累量相关指标的耐性指数进行聚类分析，将10个种质分为耐低氮型、中间型和低氮敏感型3个类群。其中，耐低氮型以E-126为典型性种质，Tifblar为低氮敏感型代表性种质。