IL-35在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化病变中的作用

朱静和，徐昌辉，钱雷，刘青员，蒋凤，于建秀，刘娟利

（滨海县人民医院1.内分泌科，2.检验科，江苏 盐城224500）

2型糖尿病（T2DM）是常见的慢性代谢性疾病［1］，血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因。研究表明糖尿病相关的动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）性疾病和急性血栓形成等疾病的发生风险增加，与高血糖诱导内皮细胞的损伤、功能障碍和死亡密切相关［2-3］。白细胞介素35（IL-35）是一种具有抗炎性能的细胞因子，在人类和小鼠中可由调节性T细胞和调节性B细胞产生［4］。研究表明稳定型心绞痛患者血清IL-35浓度显著降低［5］，但IL-35在T2DM合并颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）病变中的作用尚不清楚。本次研究探讨IL-35在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的作用，从而阐明IL-35在T2DM发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取70例2016年9月至2017年12月在滨海县人民医院诊断为T2DM的患者，其中单纯T2DM 36例，T2DM合并CAS 34例。两组年龄、性别、BMI均无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。糖尿病的诊断与分类参照《中国2型糖尿病防治指南》［6］。排除标准：伴自身免疫性疾病或内分泌疾病的糖尿病患者、应激性高血糖或1型糖尿病、继发性糖尿病、恶性肿瘤、感染性疾病、近期使用抗生素者。同时选择年龄、BMI、性别相匹配的健康人群35例作为对照组。本研究征得参加者知情同意，医院伦理委员会批准（批准号2016—09），临床资料见表1。

表1 研究对象临床资料

1.2 仪器和试剂

凋亡检测试剂盒、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）试剂盒及流式细胞仪（美国BD公司）；IL-35及可溶性VCAM-1（sVCAM-1）检测试剂盒（美国Biorad公司）；贝克曼奥林帕斯AU5800全自动生化分析仪及配套试剂；液相芯片仪（美国 Luminex公司）；实时定量PCR仪7500、cDNA逆转录试剂盒及QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Applied Biosystems公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；Ficoll-HyPaque分离液购自上海恒信试剂有限公司；D-葡萄糖粉和重组人IL-35（Sigma公司）。

1.3 方法

1.3.1 颈总动脉粥样硬化检测 患者取仰卧位，通过彩色多普勒超声诊断仪测量颈总动脉、颈动脉分叉、颈外动脉和颈内动脉任何节段中的内膜中层厚度（intima media thickness，IMT），在两侧各测 2个点，取平均值。颈动脉斑块形成或IMT＞0.9 mm定义为CAS病变。

1.3.2 外周血采集 采集所有研究对象空腹外周血8 mL，其中2 mL用于检测总胆固醇、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、空腹血糖和HbA1c等。2 mL立即分离血清存于-80℃冰箱用于批量分析IL-35浓度。4 mL用于分离外周血单个核细胞（PBMCs）。

1.3.3 外周血IL-35及sVCAM-1浓度检测 通过Luminex200液相芯片仪检测所有研究对象血清IL-35及sVCAM-1浓度，严格按照试剂说明书进行操作，测2次，取均值。

1.3.4 实时定量 PCR检测 PBMCs中 P35 mRNA和EBI3 mRNA表达水平 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法制备PBMCs，使用Trizol试剂从PBMCs分离总RNA，通过cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，再利用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒扩增IL-12 P35和EBI3。引物设计：P35正义链5′-TCCTCCCTTGAAGAACCGGA-3′，反 义 链 5′-TGACAACGGTTTGGAGGGAC-3′；EBI3正义链 5′-TCCTTCATTGCCACGTACAG-3′，反义链 5′-GCTCTGTTATGAAAGGCACG-3′；β-肌动蛋白正义链 5′-GGCACCCAGCACAATGAAG-3′反 义 链 5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′。PCR反应条件：95℃ 15 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s 40个循环。mRNA相对表达水平通过比较Ct方法计算，即相对量为 2-ΔΔCt。

1.3.5 高糖培养HUVECs及分组 无菌条件下取年轻健康孕妇分娩后的脐带，经1 g／L胶原酶和2.5 g／L胰酶消化后，收集消化液于离心管，无菌PBS冲洗脐带2遍，冲洗液一并收集至离心管中，1 000 r／min离心10 min后弃上清液。离心管内加入含20%胎牛血清、100μg／mL链霉素、100 U／mL青霉素和2 mmol／L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基混匀细胞，然后转入培养瓶，置37℃、5%CO2培养箱中培养。HUVECs培养3代后以2.5×105密度接种于6孔板中，并按需要分成4组：低糖处理组（5 mmol／L葡萄糖）、高糖处理组（25 mmol／L葡萄糖）、甘露醇组（25 mmol／L甘露醇）、IL-35+高糖组（50 ng／mL IL-35+25mmol／L葡萄糖），每组设2个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养12、24和48 h。

1.3.6 流式细胞术检测HUVECs凋亡率 收集“1.3.5”步骤中细胞，预冷 PBS洗涤 2次，2 000 r／min离心5 min，弃上清液。加适量1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至1×105，然后加入5μL Annexin V-FITC及5μL PI-PE混匀，室温避光15 min，再加入1×结合缓冲液400μL，立即上机检测。

1.3.7 流式细胞术检测HUVECs VCAM-1表达100μL PBS缓冲液重悬“1.3.5”步骤中细胞，加入10μL FITC-鼠抗人VCAM-1，室温避光孵育30 min，PBS洗涤2次，并用400μL PBS缓冲液重悬，流式细胞术检测HUVECs VCAM-1阳性率。

1.4 统计学分析

应用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，性别比较采用χ2检验；正态分布的数据用±s表示，两组比较采用t检验，3组比较采用单因素方差分析；偏态资料用中位数（M，25～75百分位数）表示，两组数据比较用Mann-Whitney U检验，3组数据比较选用Kruskal-Wallis H检验；采用Spearman分析线性相关系数。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清IL-35及sVCAM-1浓度比较

与对照组相比，单纯 T2DM组及 T2DM合并CAS患者血清IL-35浓度明显降低，且T2DM合并CAS患者下降更为显著。与对照组相比，单纯T2DM组及T2DM合并CAS患者sVCAM-1浓度明显升高，且T2DM合并CAS患者升高更为显著。见表2。相关性分析表明，T2DM合并CAS患者血清IL-35和 sVCAM-1浓度呈负相关（r＝-0.437 0，P＝0.009 8），见图1。

表2 3组患者血清IL-35和sVCAM-1浓度比较

图1 血清IL-35和sVCAM-1相关性分析

2.2 PBMCs中P35和 EBI3的mRNA表达

与对照组及单纯 T2DM组相比，T2DM合并CAS组患者PBMCs中P35 mRNA表达水平显著下降（P＜0.05），且P35 mRNA表达水平与血清 IL-35浓度呈正相关（r＝0.436 5，P＝0.009 9）。3组患者EBI3 mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）。见图2-3。

图2 各组患者P35及EBI3 mRNA水平比较

2.3 IL-35对高糖刺激后HUVECs凋亡率的影响

高糖刺激HUVECs 12 h后，低糖组与高糖组HUVECs凋亡率相比无明显差异。高糖刺激24 h后，高糖组HUVECs凋亡率较低糖组明显升高，且刺激48 h后HUVECs凋亡率更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图4。

图3 P35 mRNA水平与IL-35浓度的相关性

图4 高糖刺激后HUVECs的凋亡率

与高糖组相比，IL-35+高糖组在刺激24 h后HUVECs凋亡率无显著变化，刺激48 h后凋亡率显著下降（P＜0.05）。见图5。

图5 HUVECs经IL-35刺激后的凋亡率

2.4 IL-35对高糖刺激后HUVECs VCAM-1表达的影响

在高糖刺激HUVECs 48 h后，高糖组VCAM-1阳性率 ［6.42%（0.25% ～10.34%）］较低糖组［3.56%（0.11% ～5.87%）］明显升高（P＜0.05）。IL-35+高糖组 VCAM-1阳性率［3.73%（0.21% ～6.42%）］较高糖组明显下降（P＜0.05）。见图6。

图6 IL-35刺激48 h后HUVECs中VCAM-1阳性率

3 讨论

T2DM以高血糖、高脂血症和胰腺细胞功能障碍为主要特征，占所有糖尿病病例的90% ～95%［7］。高血糖可激活许多血管活性和炎症转录因子，如一氧化氮、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、黏附分子和细胞因子，这些因素可引起白细胞和平滑肌细胞增殖，血管收缩、血管炎症、血栓生成和AS形成，从而导致糖尿病血管并发症的发生，与AS相关的大血管并发症可导致心血管疾病和脑血管疾病的发生，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［8］。

IL-35是IL-12细胞因子家族中新确定的、具有抗炎性能的细胞因子，可通过诱导调节性T细胞和调节性B细胞的产生，抑制CD4+效应T细胞（Th1、Th2和Th17）和巨噬细胞的生物学效应，进而抑制炎症和免疫反应［5］。有研究表明，在急性冠状动脉综合征患者血清中IL-35浓度降低，可能是由于大多数IL-35由调节性T细胞分泌，而调节性T细胞比例在急性冠状动脉综合征患者血清中显著降低［5］。本次研究表明，与对照组相比，单纯T2DM组及T2DM合并CAS组患者血清IL-35浓度降低，且T2DM合并CAS组患者血清IL-35下降更明显。

IL-35由α和β链的异源二聚体组成，即由亚基p35和EBI3组成［9-10］。本次研究发现T2DM合并CAS组患者P35 mRNA表达水平下降，且与血清IL-35浓度呈正相关。但EBI3 mRNA表达水平在3组间无显著差异。这可能是因为IL-27是IL-12家族的一员，由EBI3和p28组成，与 IL-35共享亚基EBI3［11］，研究表明IL-27在内皮细胞激活和早期斑块形成过程中具有促AS的作用［12-14］。动物实验表明EBI3缺陷的小鼠更易发生 AS［15］，IL-35抑制EBI3缺陷小鼠内皮细胞炎症反应的作用不依赖于IL-27［8］。

糖尿病引起的高血糖严重损害与血液直接接触的血管内皮细胞，进而损害血管舒缩功能和纤维蛋白溶解功能，加剧炎症和氧化过程。近年来研究表明 IL-35在 AS［2］、炎症性肠病［16］和败血症［8］等多种炎症性疾病中发挥抗炎效应。系统性红斑狼疮患者血清IL-35水平下降，经糖皮质激素治疗后上调［17］。本研究通过体外高糖刺激HUVECs后，高糖组HUVECs凋亡率比低糖组明显增加，IL-35作用后HUVECs凋亡率明显下调；高糖组VCAM-1阳性率明显高于低糖组，IL-35作用后VCAM-1阳性率明显下调。表明IL-35可能通过抑制VCAM-1上调而发挥抑炎效能。

综上所述，T2DM合并CAS患者血清IL-35浓度降低，血清sVCAM-1浓度升高。高糖条件下HUVECs凋亡率升高，VCAM-1阳性率上调，IL-35+高糖共培养时，HUVECs凋亡率下降，VCAM-1阳性率降低。因此，IL-35可能通过抑制VCAM-1表达在高糖引起的内皮损伤中发挥保护作用。调控IL-35可能是治疗T2DM的有效治疗手段。但IL-35在T2DM发病过程中的确切机制尚不清楚，仍需进一步研究其在T2DM相关的AS性疾病过程中的信号传导机制。