高效石油降解菌的筛选及稳定性

田 燕, 万云洋,3, 孙午阳, 李 磊,盛晓琳, 李志明, 张枝焕,3

(1.中国石油大学(北京)地球科学学院,北京 102249; 2.中国石油大学(北京)油气资源与探测国家重点实验室,北京 102249; 3.中国石油大学(北京)油气污染防治北京市重点实验室,北京 102249)

微生物石油污染修复具有高效、无二次污染和经济的特点,受到研究者的高度重视[1-4]。土壤石油污染的微生物修复[5-8]的研究主要集中在利用无机盐培养基或牛肉膏朊胨培养基从土壤或石油中筛选石油降解菌(如竿菌属(Bacillus)[7-8]、假单胞菌属(Pseudomonas)[3,9]等),对其降解性能进行研究[4,10-12],并考察其降解菌稳定性的影响因素[4](如土壤类型[6]、营养元素、氧通量、温度和pH值等[13])。其中纤细竿菌(Bacillussubtilis)广泛地存在于土壤中并能够很好地适应不同的环境条件[14]。室外环境模拟实验主要关注生物强化技术修复土壤石油污染[4,15]以及利用碳同位素标记法鉴定芳烃降解菌[16]。但这些研究极少考虑微生物的保藏方式及时间对降解率的影响。目前菌种保藏常见方法是真空冷冻干燥法[4,17],研究发现,大多数细菌在保藏5 a时,其生物活性会降低到一个平衡点,并且可保持10 a[17]。虽然有关石油降解菌的研究很多,但迄今没有文献关注不同培养基筛培相同菌种及其降解差异性,鲜有实际污染治理的效果以及目标菌种环境稳定性和保藏稳定性[4,18]的报道。笔者在TA克隆分析石油微生物多样性基础上,改变培养基的配方,富集和筛选其中的石油降解菌并进行16S(沉降系数)核糖体脱氧核糖核酸(rDNA)序列测定,研究其污染环境稳定性,对比5 a冷冻真空干燥保藏的稳定性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用石油样(DWWZF2007JD-YY3)和环境模拟用土壤样(DWWZF2007JD-TY49)分别取自冀东油田及冀东油田未受污染的土壤,油品和土壤理化性质见文献[4]和[19]。

牛肉膏朊胨液体培养基(Ⅰ)和牛肉膏朊胨固体培养基(Ⅱ)参考文献[18]和[19]。无机盐培养基(Ⅲ):硝酸钠1.5 g,氯化钙2.0 mg,氯化钠5.0 g,硫酸铵1.5 g,磷酸氢二钾1.0 g,硫酸亚铁10.0 mg,氯化钾0.5 g,硫酸镁5.0 g,超纯水1.0 L。

1.2 石油中原位菌群的TA克隆分析

石油样中细菌多样性的测定方法。首先对原油进行预处理,即用100.0 mL异辛烷清洗等体积的原油,从大量的初始原油中浓缩微生物[20],然后利用油样提取试剂盒(QIAGEN®)提取预处理后的总DNA[21]。聚合酶链式反应(PCR)通用引物[22]，GC-338f:5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’,518r:5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’(上海生工®合成)。配制50.0 μL PCR反应混合物(参照伯乐 PCR反应试剂盒®说明):10×Taq缓冲液(含氯化镁)5.0 μL,10.0 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP mix)1.0 μL,TaqDNA聚合酶(5.0 U/μL)0.3 μL,引物各 0.5 μL, DNA提取物 2.0 μL,无菌水至50.0 μL。PCR反应程序修改自文献[22](美国伯乐C1000 PCR 仪):初始温度94 ℃(7 min),35个循环包括94 ℃(1 min),55 ℃(1 min),72 ℃(1 min);最终延伸温度72 ℃(10 min),4 ℃保存。使用TA克隆试剂盒(GenStarBiosolutions®)对总DNA的PCR产物进行TA克隆。挑选阳性克隆,由上海生工®进行鉴定。

1.3 培养基及高效石油降解菌的富集、筛选和鉴定

1.3.1 培养基组成及菌株的富集和纯化

将牛肉膏朊胨液体培养基与无机盐液体培养基按照不同体积比(0∶10(培养基Ⅲ)、1∶9、2∶8、…、10∶0(培养基Ⅰ),并依次编号为1、2、3、…、11)组成有机与无机成分含量不同的富集培养基50.0 mL,1×105Pa灭菌20 min。取0.3 g油样加入到已灭菌的各种富集培养基中,30 ℃,120 r/min水浴恒温振荡器中富集培养3 d[18]。用稀释涂布法和平板划线法(培养基Ⅱ)分离纯化细菌[4],最终得到菌落单一的菌株。

1.3.2 降解菌16S rDNA序列测定

(1)DNA提取及引物。用富集最多菌种的富集培养基对分离纯化后的单一菌株进行培养,培养液为10.0 mL,30 ℃培养3 d。用细菌DNA提取试剂盒(上海生工®)提取菌液DNA。PCR扩增采用16S rDNA序列可变区V6-V8区通用引物[23]，GC-960f:5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’,1392r:5’-ACGGGCGGTGTGTACA-3’(由上海生工®合成)。经1.0 % 的琼脂糖凝胶电泳分析检测PCR产物纯度。切割条带,提纯、测序。

(2)测序及鉴定。对实验室培养的微生物PCR产物进行测序(由上海生工®完成),所得序列经美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的基本局部相似性检索工具(BLAST)(http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST)同源性检索和分析,通过Mega6软件构建系统发育树。

1.3.3 石油微生物降解

(1)微生物对石油的降解[4,18]。所筛选菌种适存温度研究表明,菌种显示宽温度-4～85 ℃存活,最适温度为30 ℃,故本研究室内培养温度均为30 ℃。分别挑取分离的单一菌株于可富集最多菌种的富集培养基中,30 ℃恒温培养3 d;将菌液按1∶10(体积比)接入50.0 mL含0.3 g石油的1号培养基中,30 ℃、120 r/min 水浴振荡器培养7 d,重复3次驯化。用无菌水将驯化后的菌液制备成相同质量浓度的菌悬液。取该菌悬液5.0 mL接入50.0 mL含0.3 g石油的1号培养基中,30 ℃、120 r/min水浴振荡培养7 d,萃取剩余石油测定石油降解率。

(2)石油降解率测定[4]。用二氯甲烷萃取7 d后培养液中和瓶壁上的残油,液液分离后将称量瓶放在通风橱中,自然干燥,待二氯甲烷挥发后,对残油进行称重,计算石油降解率:

μ=(m0-(m2-m1))/m0.

式中,m0为1号富集培养基中所加石油的质量,g;m1为称量瓶的质量,g;m2为称量瓶及残余石油质量,g;μ为石油降解率。

1.4 降解菌的稳定性检验

1.4.1 菌种保藏对降解性能的影响

对已筛选的石油降解菌进行真空冷冻干燥保藏法[18]保存。保藏温度4 ℃,保存5 a。5 a后对保藏菌株进行活化和菌株的驯化、石油降解实验,测定菌株的石油降解率。

1.4.2 微生物降解稳定性环境模拟实验

取 100.0 g 未灭菌土样(DWWZF2007JD-TY49)风干,研磨后过0.42 mm筛,装入已灭菌 200.0 mL 的大烧杯中,加入已灭菌的石油 1.0 g,依次分别添加0(空白对照)、5.0、10.0、15.0和20.0 mL富集的相同浓度的高效石油降解菌菌液(高效石油降解菌为保藏前菌种,用无菌水将菌液制备成相同浓度的菌悬液)[18],搅拌均匀,放在室外。根据冀东当地的环境条件[4],选择冬季这种低温环境,更好地研究菌种在非最适温度(最适温度为30 ℃)条件下的稳定性。环境模拟实验为期60 d[18],期间的环境条件:温度为-9～-8 ℃,降水量 12.7 mm,日照时间 400.4 h,雨雪天数 5 d。60 d后,萃取土样中残余石油[24],并用柱层析法进行族组分分离[25]。所有处理重复3次。

2 结果分析

2.1 样品中降解菌的筛培与鉴定

对TA克隆测序结果进行多样性指数分析,稀释度曲线(图1)趋于平缓,表明TA克隆测序结果趋于饱和。文库的覆盖率(coverage)(表1)为99.3%,理论上该文库能够较全面地反映了石油样品中的微生物多样性,满足样品微生物的富集和筛选要求。本文中用TA克隆技术共检出细菌8属18种和古菌4种(表2),表明该石油样品中的微生物可能以细菌为主。如竿菌属[26]、假单胞菌属、石杆菌属(Petrobacter)[27]、卤单胞菌属(Halomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、脱硫化弧菌属(Desulfovibrio)和淀粉液化竿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[28]。其中竿菌属和假单胞菌属的丰度最高,也是最常见的石油降解菌[3,7,29]。

图1 石油样品TA克隆测序结果的稀释度曲线Fig.1 Rarefaction curve of TA clone sequences from oil sample

表1 TA克隆多样性指数及覆盖率Table 1 Diversity index and coverage of TA clone

以上述TA克隆检测结果为基础,通过改变富集培养基的配方,以求筛选出更多的石油降解菌。11个培养基共筛选7株不同的石油降解菌(表3)。培养基配方只简单配置了有机与无机的比例,从培养的结果发现,各个培养基的培养结果仍然具有一定的差异。其中1、7和9号培养基富集出的菌株最多,分别获得5、6和6株,其他培养基只获得1～3株菌,9号培养基中XJ02仅有单菌落(表3、4)。每种培养基平均富集得到的菌株数量中,7号培养基最多(表4),因此初步判断7号培养基在11个培养基中相对具有较好的效果,作为本实验的富集培养基。菌种的16S rDNA结果的系统进化树见图2(该树是根据毗邻链接方法建立的,辅助程序值是1 000,重复串树中只显示大于50%的值。括号中的序号代表菌株的GenBank登录号;菌种比对网址为 http://www.ezbiocloud.net/;分支点上的数字代表计算1 000 次聚类到一起的几率;标尺刻度代表1%的序列差异)。从图2和基因库比对结果(表3)可见,通过培养基筛选得到的菌属为TA克隆检测结果中的优势菌属,共得2属7株,主要为竿菌属和少量的假单胞菌属。其中20110119NP-YY0-XJ01(简写为XJ01)在NCBI中比对为未分类细菌(bacterium HBS-1，表3),但在模式种比对中却与中村氏竿菌(Bacillusnakamurai)(图2)最相似。XJ03和XJ07(表3)是假单胞菌属,其他均为竿菌属。在竿菌属中XJ02和XJ15(表3)属于纤细竿菌(Bacillussubtilis)[26]。这些微生物与报道的油田菌种[3,21]相似。所设计的培养条件未能筛培出TA克隆检出的弧菌(表3)。

表2 TA克隆测序结果在基因库中比对结果Table 2 Comparison results of TA clone sequencing in GenBank

表3 测序菌株在基因库中的比对结果及其可富集的培养基编号Table 3 Comparison results of sequencing in GenBank and enriched medium number corresponding strains

注:菌种编号中,“20110119”是指2011年1月19日筛选的此菌种,“NP”为采样地点,“YY0”为样品性质,“XJ”为细菌的缩写。

表4 不同富集培养基可富集的菌种数量Table 4 Genera amounts enriched by different enriched mediums

注:“a”表示3次平行实验。

图2 菌种的16S rDNA结果的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA based library obtained

2.2 降解菌保藏前后的降解稳定性

对筛选出的7株菌进行石油降解室内实验表明,假单胞菌属的两株菌XJ03和XJ07的降解率较低,分别为36.5%和25.1%。降解率最高的为竿菌属XJ09和XJ15,分别为54.2% 和64.5%。XJ02的降解率明显低于同为纤细竿菌的XJ15,仅有34.5%。两者差别仅为富集培养基不同,XJ02由无机盐培养基富集(1号、2号和3号培养基)筛选得到,而XJ15主要由有机培养基(7号培养基)富集筛选得到。

纤细竿菌可由不同的培养基筛选,但所获不同菌株的石油降解性能有差异。无机盐培养基筛选出的纤细竿菌(XJ02和XJ15)对石油的降解率分别为39.5%[32]和34.5%,仅约为有机培养基所筛降解率69.9%[33]和64.5%的一半。可见有机成分的存在可能更有利于高效石油降解菌的筛选。

研究表明,多数菌种的活性有所下降并在第五年时达到稳定期[17]。本次研究认为即便是具有活性的菌种,保藏5 a后其降解性能比保藏前也有不同程度的下降(图3)。保藏前的高效石油降解菌XJ09和XJ15在保藏后的降解率分别为50.6%和59.9%(图3),分别降低了4.5 %和4.7 %。XJ01、XJ02及XJ06的降解率分别为25.5 %、29.3 %和31.6 %(图3),与保藏前相比,分别下降了2.4%、5.2 %和7.0%。与竿菌属相比,假单胞菌属的降解性能衰减程度更大。XJ03和XJ07的降解率分别为17.2%和10.6%(图3),下降了9.2 %和14.5 %,约为保藏前的一半。

显然5 a真空冷冻干燥保藏,竿菌属(XJ01、XJ02、XJ06、XJ09和XJ15)只有轻微衰减,稳定性高于假单胞菌属(XJ03和XJ07)。微生物的这种降解性能是否可保持10 a 或更久,与菌种类别密切相关。

图3 菌株5 a保存前后的石油降解率Fig.3 Oil-degradation rates of enriched strains before and after 5 year conservation

2.3 环境模拟实验中降解菌稳定性

冀东油田当地气温普遍较低,年平均气温为12.5 ℃,月平均最低气温-2.5 ℃[4],因此本文中选择冬天进行室外环境模拟实验,研究环境条件变化对菌种稳定性的影响。用室内筛选的两株高效石油降解菌XJ09和XJ15,进行为期60 d的室外环境模拟实验[18],结果见图4。其中(5)、(10)、(15)和(20)为添加菌液的体积(mL,菌液浓度为1×108个/mL);Control为未加菌液的空白对照。可以看出,XJ09和XJ15对石油的降解率相对于室内的降解结果(图3)有所下降,但是随着菌量的增加,石油的降解率逐渐增加,最高降解率分别为50.8%和53.4%。这个结果表明两株菌的低温适宜性对于冀东油田现场的低温石油污染修复有利,也表明这两株菌在低温环境中的降解具有稳定性和适应性。

XJ09和XJ15的石油降解率的增速随着菌量的增加呈现了不同的现象(图4)。XJ09的降解率呈现了很好的线性关系,并且呈等距离增长;而XJ15当菌量增加到15.0 mL时,其增速放缓。为了研究该现象,对不同处理的残余油进行族组分分离[4],研究各组分的降解率及可能造成增速不一致的原因(图4)。

图4表明,XJ09和XJ15对饱和烃和沥青质都有很好的降解效果,随着菌量的增加,饱和烃和沥青质的质量都会随之减少。尤其是饱和烃,当菌量添加到20.0 mL时,基本完全被降解(XJ09处理的样品中完全降解,XJ15处理的样品中,饱和烃的残余质量小于0.05 g)(图4)。沥青质的降解率在添加量为15.0 mL时达到45.2%(XJ15)～52.6%(XJ09)。

从实验结果看,XJ09和XJ15对芳烃的降解效果不明显(尤其是XJ15,增加的质量比XJ09多)。就多环芳烃(PAHs)而言(表5),有害的优控PAHs大部分下降或消失,但的确存在苝的质量有所上升,相对分子质量更大的芳烃是否也存在类似的增多现象值得进一步研究。推测这种降解产物中芳烃浓度的增加影响了XJ15增速变化。在菌量增加至15.0 mL时,原油的降解产物中芳烃的质量是空白对照(即未经过微生物降解)的2倍,与此不同的是XJ09的降解产物中芳烃的质量(菌量为20.0 mL)约为空白对照的1.5倍,与XJ15在菌量为10.0 mL时的芳烃质量相当(图4),这可能说明当环境中芳烃增加到一定浓度时会抑制微生物对原油的降解。

图4 环境模拟实验XJ09和XJ15菌对石油的降解效果Fig.4 Oil-degradation results of two selected strains after circumstance experiments

表5 环境模拟实验前后芳烃峰面积计算Table 5 Analysis of PAHs area before and after circumstance experiments

XJ09和XJ15对非烃的降解也存在一定的差异。如XJ15对非烃的降解效果很好,降解率达到55.3 %(菌量添加量为20.0 mL,图4)，而XJ09对非烃的降解率也是不降反增,这可能是沥青质降解产生大量醛类所致[34-35]。

3 结 论

(1)同为纤细竿菌,无机盐培养基筛选的菌株降解率仅为有机培养基筛选的菌株的53.5%。

(2)真空冷冻干燥保藏5 a,菌株的降解性能有所下降,但是竿菌属的石油降解稳定性优于假单胞菌属。

(3)相对于室内稳定的环境条件,室外环境对高效降解菌的降解性能具有一定的抑制作用,但仅使其降解率降低了3.4%(XJ09)～11.1 %(XJ15)。

(4)在原油降解过程中,如代谢产物芳烃浓度升高,会对菌种石油降解产生一定的抑制。

致谢感谢王靖教授和微生物地质学实验室的老师和同学们的支持!