槲皮素抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖作用研究

张静玲，王克利，闫双宝

(1.北京科技大学医院 内科，北京100088；2.火箭军总医院 骨科，北京100088)

槲皮素(Quercetin)是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物，广泛存在于许多膳食植物(水果、蔬菜、谷物等)中，以中荞麦、西红柿、山碴、洋葱中含量较高。许多中草药如罗布麻、槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏等均含有槲皮素。张晓琳等[1]发现，50-200 μmol/L槲皮素在体外可剂量依赖地抑制神经胶质瘤细胞株，并具有神经元保护作用。研究表明，口服槲皮素可明显抑制大鼠、小鼠结直肠癌生长，抑制其凋亡[2,3]。本研究旨在探讨槲皮素抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖及促进其凋亡作用，为探讨槲皮素抗肿瘤作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1骨肉瘤细胞株MG-63的培养

人骨肉瘤细胞株MG-63购自武汉普诺赛生命科技有限公司。MG-63细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养，取处于对数生长期细胞用于实验研究。

1.2试剂与仪器

胎牛血清、MEM培养液及TRIzol为Gibco产品;MTT、DMSO及胰酶购自北京鼎国科技有限公司;细胞凋亡检测试剂盒为深圳碧云天公司产品;二步法RT-qPCR法检测试剂盒、哺乳动物总蛋白提取试剂盒、Bradford蛋白定量试剂盒均为北京全式金生物技术有限公司产品;抗人GAPDH、caspase 3及其前体抗体产自北京中杉金桥生物技术有限公司;PVDF膜为美国Millipore公司产品;其他试剂均为进口或国产分析纯。

酶联免疫检测仪由美国MD公司生产;流式细胞仪为美国BD公司产品;凝胶成像系统为上海天能产品。

1.3细胞增殖活力检测

以MTT法检测细胞增殖活力。将处于对数生长期的MG-63以1×103/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，分别用常规培养液及含20、40和80 μmol/L槲皮素的MEM培养液200 μl处理24 h、48 h及72 h，加入20 μl MTT溶液，以150 μl DMSO溶解沉淀，以酶联免疫检测仪于OD490 nm处测量各孔的吸光值。根据各组细胞OD值计算药物对细胞生长的抑制率，实验设6个复孔并重复3次。

1.4流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

处于对数生长期的MG-63细胞以1×106接种于6孔板，分别以无血清MEM培养液及含40 μmol/L槲皮素的MEM无血清培养液培养48 h后，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、70%乙醇固定，用Anexin V和PI对其进行染色，用流式细胞术分析各组细胞凋亡情况。实验设3个复孔并重复3次。

1.5逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

以二步法RT-qPCR法检测MG-63细胞caspase 3 mRNA的相对表达量。将处于对数生长期的MG-63细胞按1.3分组培养，以TRIzol法按说明书提取MG-63细胞总RNA，进行逆转录，然后以caspase 3特异性引物进行PCR。以GAPDH做为内参，按2-ΔΔCT计算caspase 3相对表达量。ΔΔCT=[Ct(槲皮素组caspase 3)-Ct(槲皮素组GAPDH)]-[Ct(对照组caspase 3)-Ct(对照组GAPDH)]。GAPDH引物序列为：5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’，5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’;caspase 3引物序列为：5’-CGGAGCTTGGAACGCGA-3’，5’-ACACAAGCCCATTTCAGGGTA-3’。

1.6WesternBlot检测

用Western Blot检测各组MG-63细胞caspase 3及其前体表达情况。将处于对数生长期的MG-63细胞按1.3分组培养后，按哺乳动物总蛋白提取试剂盒说明书进行MG-63细胞总蛋白提取，并用Bradford法进行蛋白定量，取50 μg细胞总蛋白(20 μl)进行SDS-PAGE电泳、转膜后，以特异性caspase 3及其前体进行Western Blot检测，经ECL发光后用凝胶成像系统检测。以GAPDH做为内参照，计算caspase 3及其前体的相对表达量。

1.7数据处理与分析

2 结果

2.1槲皮素对MG-63细胞增殖活力影响

不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)槲皮素作用MG-63细胞一定时间(24、48、72 h)后，以MTT法分析各组细胞增殖能力，计算其抑制率，结果见表1，80 μmol/L槲皮素处理MG-63细胞24 h后，抑制率为76.2%±6.2%，明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05);不同剂量槲皮素处理MG-63细胞48 h后，各剂量槲皮素处理组细胞抑制率均明显低于正常对照组，且呈现明显的剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)；不同剂量槲皮素处理MG-63细胞72 h后，各剂量槲皮素处理组细胞抑制率均明显低于正常对照组，且40 μmol/L和80 μmol/L槲皮素处理组抑制率明显低于20 μmol/L槲皮素处理组(P<0.05)。

以上结果可见，MG-63细胞用槲皮素处理48 h后，槲皮素对其增殖活力呈现了较好的剂量依赖作用，而40 μmol/L处理MG-63 48 h时间，其抑制率为66.8%±8.6%，故以下研究将采用此浓度和处理时间进行。

表1 不同浓度对MG-63细胞增殖抑制作用结果

与相同时间点对照组比较，*P<0.05;与相同时间点20 μmol/L槲皮素处理组比较，#P<0.05;与相同时间点40 μmol/L槲皮素处理组比较，ΔP<0.05。

2.2槲皮素对MG-63细胞凋亡影响

FCM检测结果显示，正常培养的MG-63细胞凋亡率为9.8%±0.7%，40 μmol/L槲皮素处理MG-63细胞48 h后，MG-63细胞凋亡率达46.2%±6.2%，明显高于正常对照组，二者差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3槲皮素对MG-63细胞caspase3表达影响

RT-qPCR结果显示，槲皮素处理后MG-63细胞caspase 3 mRNA相对表达量是对照组的1.5倍左右(1.50±0.18)，差异有统计学意义(P<0.05)。

Western blot结果显示，槲皮素处理后，MG-63细胞caspase 3前体相对表达量为0.86±0.11，明显高于常规培养的MG-63细胞，差异有统计学意义(P<0.05);对水解后的caspase 3，其在槲皮素处理后的MG-63细胞相对表达量亦明显高于未处理组的MG-63细胞，二者差异有统计学意义(P<0.05);进一步分析结果显示，在槲皮素处理后的MG-63细胞，caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)亦明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1,表2。

图1 槲皮素对MG-63细胞caspase 3表达影响

表2 槲皮素对MG-63细胞caspase 3表达影响

与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

槲皮素作为一种自然界天然存在的黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保护心血管、免疫抑制和维持血糖等稳定强大的生物活性和广泛的药理作用，对感染，心血管疾病、糖尿病、肿瘤和自身免疫病等疾病的治疗及预防具有重要的临床意义[4]。研究表明，槲皮素可以通过多条信号通路影响肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡、代谢，对直结肠癌、胃癌、乳腺癌及白血病等多种肿瘤均有抑制作用[5]。本研究发现，20-80 μmol/L槲皮素均可抑制MG-63细胞的增殖活力，且在48 h时，槲皮素抑制MG-63细胞增殖活力作用具有明显剂量依赖作用，细胞凋亡检测结果显示，40 μmol/L槲皮素可明显促进骨肉瘤细胞的凋亡，表明槲皮素具有促进MG-63凋亡、抑制其增殖活力作用。

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，参与多种因素诱导的细胞凋亡。正常组织中，Caspase 3以无活性的酶原形式存在，主要分布于胞浆内，凋亡早期，Caspase 3即被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17 KD)和两个小亚基(12 KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。本研究发现，槲皮素可刺激MG-63细胞Caspase 3的mRNA表达，同时，Western Blot分析结果显示，槲皮素处理后，MG-63细胞caspase 3前体相对表达量明显高于常规培养的MG-63细胞，而水解后的caspase 3相对表达量亦明显高于常规培养的MG-63细胞，同时，caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)明显增加，表明刺激MG-63细胞转录和表达caspase 3，加速其裂解，槲皮素抑制MG-63细胞增殖活力作用可能与其激活caspase 3通路有关。