槲皮素抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖作用研究

2018-10-31 01:27张静玲王克利闫双宝
中国实验诊断学 2018年10期
关键词:素处理前体槲皮素

张静玲,王克利,闫双宝

(1.北京科技大学医院 内科,北京100088;2.火箭军总医院 骨科,北京100088)

槲皮素(Quercetin)是一种具有多种生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于许多膳食植物(水果、蔬菜、谷物等)中,以中荞麦、西红柿、山碴、洋葱中含量较高。许多中草药如罗布麻、槐米、侧柏叶、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、银杏等均含有槲皮素。张晓琳等[1]发现,50-200 μmol/L槲皮素在体外可剂量依赖地抑制神经胶质瘤细胞株,并具有神经元保护作用。研究表明,口服槲皮素可明显抑制大鼠、小鼠结直肠癌生长,抑制其凋亡[2,3]。本研究旨在探讨槲皮素抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖及促进其凋亡作用,为探讨槲皮素抗肿瘤作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1骨肉瘤细胞株MG-63的培养

人骨肉瘤细胞株MG-63购自武汉普诺赛生命科技有限公司。MG-63细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养,取处于对数生长期细胞用于实验研究。

1.2试剂与仪器

胎牛血清、MEM培养液及TRIzol为Gibco产品;MTT、DMSO及胰酶购自北京鼎国科技有限公司;细胞凋亡检测试剂盒为深圳碧云天公司产品;二步法RT-qPCR法检测试剂盒、哺乳动物总蛋白提取试剂盒、Bradford蛋白定量试剂盒均为北京全式金生物技术有限公司产品;抗人GAPDH、caspase 3及其前体抗体产自北京中杉金桥生物技术有限公司;PVDF膜为美国Millipore公司产品;其他试剂均为进口或国产分析纯。

酶联免疫检测仪由美国MD公司生产;流式细胞仪为美国BD公司产品;凝胶成像系统为上海天能产品。

1.3细胞增殖活力检测

以MTT法检测细胞增殖活力。将处于对数生长期的MG-63以1×103/孔接种于96孔板,待细胞贴壁后,分别用常规培养液及含20、40和80 μmol/L槲皮素的MEM培养液200 μl处理24 h、48 h及72 h,加入20 μl MTT溶液,以150 μl DMSO溶解沉淀,以酶联免疫检测仪于OD490 nm处测量各孔的吸光值。根据各组细胞OD值计算药物对细胞生长的抑制率,实验设6个复孔并重复3次。

1.4流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

处于对数生长期的MG-63细胞以1×106接种于6孔板,分别以无血清MEM培养液及含40 μmol/L槲皮素的MEM无血清培养液培养48 h后,用0.25%胰蛋白酶溶液消化、70%乙醇固定,用Anexin V和PI对其进行染色,用流式细胞术分析各组细胞凋亡情况。实验设3个复孔并重复3次。

1.5逆转录-定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

以二步法RT-qPCR法检测MG-63细胞caspase 3 mRNA的相对表达量。将处于对数生长期的MG-63细胞按1.3分组培养,以TRIzol法按说明书提取MG-63细胞总RNA,进行逆转录,然后以caspase 3特异性引物进行PCR。以GAPDH做为内参,按2-ΔΔCT计算caspase 3相对表达量。ΔΔCT=[Ct(槲皮素组caspase 3)-Ct(槲皮素组GAPDH)]-[Ct(对照组caspase 3)-Ct(对照组GAPDH)]。GAPDH引物序列为:5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’,5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’;caspase 3引物序列为:5’-CGGAGCTTGGAACGCGA-3’,5’-ACACAAGCCCATTTCAGGGTA-3’。

1.6WesternBlot检测

用Western Blot检测各组MG-63细胞caspase 3及其前体表达情况。将处于对数生长期的MG-63细胞按1.3分组培养后,按哺乳动物总蛋白提取试剂盒说明书进行MG-63细胞总蛋白提取,并用Bradford法进行蛋白定量,取50 μg细胞总蛋白(20 μl)进行SDS-PAGE电泳、转膜后,以特异性caspase 3及其前体进行Western Blot检测,经ECL发光后用凝胶成像系统检测。以GAPDH做为内参照,计算caspase 3及其前体的相对表达量。

1.7数据处理与分析

2 结果

2.1槲皮素对MG-63细胞增殖活力影响

不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)槲皮素作用MG-63细胞一定时间(24、48、72 h)后,以MTT法分析各组细胞增殖能力,计算其抑制率,结果见表1,80 μmol/L槲皮素处理MG-63细胞24 h后,抑制率为76.2%±6.2%,明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同剂量槲皮素处理MG-63细胞48 h后,各剂量槲皮素处理组细胞抑制率均明显低于正常对照组,且呈现明显的剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);不同剂量槲皮素处理MG-63细胞72 h后,各剂量槲皮素处理组细胞抑制率均明显低于正常对照组,且40 μmol/L和80 μmol/L槲皮素处理组抑制率明显低于20 μmol/L槲皮素处理组(P<0.05)。

以上结果可见,MG-63细胞用槲皮素处理48 h后,槲皮素对其增殖活力呈现了较好的剂量依赖作用,而40 μmol/L处理MG-63 48 h时间,其抑制率为66.8%±8.6%,故以下研究将采用此浓度和处理时间进行。

表1 不同浓度对MG-63细胞增殖抑制作用结果

与相同时间点对照组比较,*P<0.05;与相同时间点20 μmol/L槲皮素处理组比较,#P<0.05;与相同时间点40 μmol/L槲皮素处理组比较,ΔP<0.05。

2.2槲皮素对MG-63细胞凋亡影响

FCM检测结果显示,正常培养的MG-63细胞凋亡率为9.8%±0.7%,40 μmol/L槲皮素处理MG-63细胞48 h后,MG-63细胞凋亡率达46.2%±6.2%,明显高于正常对照组,二者差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3槲皮素对MG-63细胞caspase3表达影响

RT-qPCR结果显示,槲皮素处理后MG-63细胞caspase 3 mRNA相对表达量是对照组的1.5倍左右(1.50±0.18),差异有统计学意义(P<0.05)。

Western blot结果显示,槲皮素处理后,MG-63细胞caspase 3前体相对表达量为0.86±0.11,明显高于常规培养的MG-63细胞,差异有统计学意义(P<0.05);对水解后的caspase 3,其在槲皮素处理后的MG-63细胞相对表达量亦明显高于未处理组的MG-63细胞,二者差异有统计学意义(P<0.05);进一步分析结果显示,在槲皮素处理后的MG-63细胞,caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)亦明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),见图1,表2。

图1 槲皮素对MG-63细胞caspase 3表达影响

表2 槲皮素对MG-63细胞caspase 3表达影响

与对照组比较,*P<0.05。

3 讨论

槲皮素作为一种自然界天然存在的黄酮类化合物,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、保护心血管、免疫抑制和维持血糖等稳定强大的生物活性和广泛的药理作用,对感染,心血管疾病、糖尿病、肿瘤和自身免疫病等疾病的治疗及预防具有重要的临床意义[4]。研究表明,槲皮素可以通过多条信号通路影响肿瘤细胞的增殖、转移、凋亡、代谢,对直结肠癌、胃癌、乳腺癌及白血病等多种肿瘤均有抑制作用[5]。本研究发现,20-80 μmol/L槲皮素均可抑制MG-63细胞的增殖活力,且在48 h时,槲皮素抑制MG-63细胞增殖活力作用具有明显剂量依赖作用,细胞凋亡检测结果显示,40 μmol/L槲皮素可明显促进骨肉瘤细胞的凋亡,表明槲皮素具有促进MG-63凋亡、抑制其增殖活力作用。

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,参与多种因素诱导的细胞凋亡。正常组织中,Caspase 3以无活性的酶原形式存在,主要分布于胞浆内,凋亡早期,Caspase 3即被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17 KD)和两个小亚基(12 KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。本研究发现,槲皮素可刺激MG-63细胞Caspase 3的mRNA表达,同时,Western Blot分析结果显示,槲皮素处理后,MG-63细胞caspase 3前体相对表达量明显高于常规培养的MG-63细胞,而水解后的caspase 3相对表达量亦明显高于常规培养的MG-63细胞,同时,caspase 3裂解比例(caspase 3cleaved-/pro-)明显增加,表明刺激MG-63细胞转录和表达caspase 3,加速其裂解,槲皮素抑制MG-63细胞增殖活力作用可能与其激活caspase 3通路有关。

猜你喜欢
素处理前体槲皮素
毛壳素对绒山羊ADSCs组蛋白甲基化修饰的影响研究
展向压力分布可控的前体/压缩面气动设计方法及其流动特性
N-末端脑钠肽前体与糖尿病及糖尿病相关并发症呈负相关
黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响及其相关机制
槲皮素金属配合物合成及药理作用研究现状
槲皮素药理学作用的研究进展
槲皮素对非对称性二甲基精氨酸诱导损伤的脑血管内皮细胞的保护作用及其机制研究
促胃泌素释放肽前体对小细胞肺癌的诊断价值
槲皮素在Caco-2单层细胞模型上的跨膜吸收和甲基化代谢
亚麻籽油前体脂质体稳定性及释放性能研究