OGD动态处理后大鼠海马神经元线粒体裂解及凋亡相关蛋白的变化

李学涵，刘学良，王 平，吕志宇，吴 勇，陈 秀

(1. 西南医科大学附属医院神经内科，四川泸州 646000；2. 成都市新都区新都中医医院老年病科，四川成都 610500)

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke, AIS)引起的病理生理机制主要是缺血缺氧造成细胞损伤，进而引起细胞凋亡或者坏死，造成不可逆性神经细胞损害。线粒体膜通透性、线粒体形态在缺血缺氧后随即发生变化，先于各种凋亡蛋白的产生，对凋亡的发生有着重要的影响，具有潜在干预前景[1]。

线粒体动力相关蛋白(dynamic related protein, Drp1)，不仅是线粒体裂解始动调节蛋白，并且与缺血缺氧后细胞保护相关[2]。正常情况下，Drp1蛋白以一种磷酸化失活状态(P-Drp1)存在于胞质内[3]，在缺血缺氧后迅速脱磷酸化，由细胞质内转移到线粒体外膜上，触发线粒体裂解进程[4]。与此同时，Drp1调节线粒体外膜通透性，以实施对细胞色素 C(CytC)的释放[5]。进入胞质的CytC结合凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)形成Apaf-1-CytC复合体。此复合体可激活caspase-9，活化的 caspase-9激活 caspase-3和caspase-7，从而启动了caspase级联反应，导致细胞凋亡[6]。

本研究观察经过不同时间的OGD处理后，大鼠海马神经元胞体线粒体形态改变、动力相关蛋白变化，以及凋亡相关蛋白的变化，探讨线粒体裂解对神经元凋亡的影响，以期为今后调节线粒体动态平衡关键靶点的后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1一般材料细胞爬片经消毒后，置入6孔板中，多聚赖氨酸包被细胞爬片，PBS漂洗，吹干待用。SD大鼠孕鼠(孕16～18 d)，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.177 mol/kg)，无菌条件下剖腹取胎鼠，孕鼠断颈处死。参照文献[7]对海马神经元进行提取培养。调整细胞密度为5×105个/mL，滴加于细胞爬片上。

1.2方法

1.2.1 β Tublin Ⅲ蛋白行神经元鉴定 参照文献[8]对神经元进行鉴定，荧光显微镜观察鉴定结果。

1.2.2 OGD处理并用共聚焦显微镜观察线粒体形态及蓝染细胞核形态的改变 随机将细胞分为对照组和试验组。对照组：直接进行Mito Tracker染色处理。试验组：将细胞爬片从6孔板中捞起，浸入无糖培养基中[DMEM：(+)L-glutamine(-)D-glucose(-)sodium pyruvate]，将细胞置入缺氧模块化孵化室中(modular incubator chamber, CA 92014)，充混合气体(950 mL/L N2，50 mL/L CO2)1 min后，关闭进、出气口，置入孵箱中保证37 ℃环境温度。上述处理，每次置入3个细胞爬片，共处理4次，处理时间分别是30、45、60、90 min。后续处理同对照组。并用共聚焦显微镜观察对照组及试验组线粒体形态及蓝细胞核形态的改变。

1.2.3 JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm) 50 μL JC-1(200×)加入8 mL超纯水比例稀释，混匀，加入2 mL JC-1染色缓冲液(5×)，即为JC-1工作液。按照1.2.2项方法OGD处理对照组、试验组后，将6孔板内液体更换为JC-1工作液，每孔1 mL，室温下孵育20 min。观察前用PBS漂洗1遍，荧光显微镜下观察。

1.2.4 Western blot检测P-Drp1、caspase 3的表达 提取对照组、试验组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，配平蛋白浓度；制胶，上样蛋白，电泳，转膜，孵一抗，漂洗，孵二抗，漂洗。同时测定内参β-actin蛋白的表达。曝光成像。运用凝胶定量软件Image J分析灰度值。

1.2.5 提取胞质中CytC，并用Western blot检测其表达 同上设置对照组、试验组，使用线粒体提取试剂盒将每一组细胞中的线粒体去除，然后提取剩余胞质中总蛋白，并用Western blot检测胞质中CytC的表达。

2 结 果

2.1原代海马神经元的培养及鉴定结果神经元形态(图1)：β Tublin Ⅲ蛋白染色后，在荧光显微镜观察下，神经元整个显示绿色荧光。

2.2激光共聚焦显微镜观察线粒体形态及蓝色细胞核形态的改变线粒体形态结果显示，海马神经元线粒体在OGD处理30 min时已发生裂解，并随着处理时间延长，线粒体裂解成更小形态的线粒体，裂解线粒体的数量增加(图2)；根据文献，将线粒体分为管状、棒状以及球状，分别代表正常线粒体、线粒体肿胀以及裂解[11]，3种形态线粒体在各实验组中所占比例见表1。

表13种形态线粒体在各组间所占比例以及裂解率

Tab.1 The proportion and cleavage rate of three types of mitochondria in each group

(%)

总体趋势χ2=73.77，n=4，P<0.05。

图1荧光显微镜下观察大鼠海马神经元

Fig.1 Rat hippocampal neurons observed under fluorescence microscope

A：DAPI染色细胞核；B：β Tublin Ⅲ染色神经元微管；C：merged。

图2激光共聚焦显微镜观察的线粒体裂解情况

Fig.2 Mitochondrial cleavage observed by laser confocal microscopy

A：0 min；B：30 min；C：45 min；D：60 min；E：90 min。

2.3荧光显微镜观察线粒体膜电位的改变荧光显微镜下观察可见(图3)：空白对照组，全部线粒体呈现高亮橙色，未见绿色荧光，表明线粒体膜电位正常；30 min组，神经元胞体线粒体呈现中亮绿色荧光，轴突大部分线粒体呈现高亮橙色荧光；45 min组，神经元胞体线粒体呈现稍高亮绿色荧光，轴突大部分线粒体呈现中亮橙色荧光；60 min组，神经元胞体呈现亮绿色荧光，轴突部分线粒体呈现中亮橙色荧光；90 min组，神经元胞体以及轴突大部分呈现高亮绿色荧光，轴突少部分呈现微弱橙色荧光；CCCP组(线粒体膜电位完全崩解，作为本次试验的阴性对照)，全部线粒体出现绿色荧光，膜电位丧失。

图3荧光显微镜观察线粒体膜电位的改变

Fig.3 The change of mitochondrial transmembrane potential observed by fluorescence microscopy

A：对照组；B：30 min；C：45 min；D：60 min；E：90 min；F：CCCP组。

2.4P-Drp1蛋白在各组的表达情况P-Drp1的表达结果(图4)：0 min组P-Drp1高表达，30 min组P-Drp1蛋白表达下降，并伴随着OGD处理时间延长P-Drp1表达进一步降低(图4A)；与对照组相比，30、45、60、90 min P-Drp1蛋白表达逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.05，图4B)。

图4各组细胞中P-Drp1蛋白表达情况

Fig.4 The expression of P-Drp1 protein in cells of each group

A：Western blot蛋白条带；B：P-Drp1蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值的统计学结果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

2.5CytC在对照组、试验组胞质中的表达情况图5A显示：在0 min组、30 min组及45 min组胞质中CytC含量极低，但在60 min、90 min组胞质中可见CytC高表达。图5B显示：与0 min组相比，30 min组、45 min组CytC蛋白的表达无明显变化(P>0.05)；与0 min组相比，60 min组及90 min组CytC蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.6Western-blot检测细胞中caspase3的表达0 min、30 min、45 min可见caspase 3 低表达，60 min、90 min可见caspase 3高表达(图6A)；与0 min组相比，30 min 组、45 min组 caspase 3蛋白的表达无明显增加，差异无统计学意义(P>0.05)，与0 min组相比，60 min组 、90 min组 caspase 3蛋白的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05，图6B)。

2.7组间蛋白灰度值的统计学结果与对照组相比，实验组P-Drp1蛋白表达逐渐下降，差异有统计学意义，组内比较，30 min组与45 min组无统计学差异；与对照组相比，60 min组与90 min组CytC蛋白表达上升，差异有统计学意义，组内比较，0 min与30 min组，30 min组与45 min组，45 min组与60 min组，60 min组与90 min组差异无统计学意义；与对照组相比，60 min组与90 min组caspase 3蛋白表达上升，差异有统计学意义，组内比较，0 min组与45 min组，60 min组与90 min组差异无统计学意义(表2)。

图5各分组胞质中CytC的表达

Fig.5 The expression of CytC in cytoplasm of cells in each group

A：Western blot蛋白条带；B：CytC蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值的统计学结果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

图6各分组中caspase3的表达

Fig.6 The expression of caspase 3 in cytoplasm of cells in each group

A：Western blot蛋白条带；B：caspase 3蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值的统计学结果。a：0 min；b：30 min；c：45 min；d：60 min；e：90 min。

表2各组P-Drp1、CytC、caspase3相对灰度值的比较

Tab.2 Relative gray value of P-Drp1, CytC, and caspase 3 in different groups

分组P-Drp1CytCcaspase 3对照组102.058±14.99740.059±12.31538.402±9.175 30min组84.315±8.543∗ 55.882±16.74345.029±11.11045min组80.419±9.911∗62.998±15.133 43.436±9.30760min组51.848±20.802∗ 108.138±15.005∗89.445±5.846∗90min组32.920±10.363∗ 110.401±26.379∗ 90.231±5.869∗

与对照组比较，*P<0.05。

3 讨 论

既往试验中，正常生理条件下，线粒体处于不断融合与裂解的动态平衡中，将线粒体裂解程度从完全裂解至无裂解分为1～5级，那么正常线粒体动态平衡状态处于3～4级，与本试验结果相符合[9]。

正常线粒体膜电位与线粒体内膜高度不通透性是线粒体保持正常生理功能的前提，线粒体膜电位改变是反映线粒体通透性改变的最佳指标之一[4]。线粒体膜通透性增加达到某阈值后，线粒体内外两层膜之间的CytC随着线粒体裂解，游逸到胞质内，触发caspase家族级联反应[10]。本次试验通过检测线粒体膜电位改变以及CytC表达，从而反映线粒体膜渗透性的改变。图2、表2显示，线粒体膜电位在OGD处理30min时已下降，并随着OGD处理时间延长而进一步下降；膜通透性随着OGD处理而增加，且随着OGD处理时间延长通透性进一步增加，并且在60 min后引起CytC释放入胞质。

在细胞凋亡进程中，CytC触发激活caspase 9，进而激活caspase 3，进而进展到不可逆性凋亡阶段；根据文献，神经元凋亡相关指标在OGD后1 h出现明显变化，引起轻微的细胞损伤[11-12]，与本次试验结果相符。

2016年，RITA等[13]在实验中揭示了在45 min OGD过程中，线粒体裂解增强但是不伴凋亡的发生；此时立即复氧，线粒体暂时性回归裂解前状态。该研究OGD过程结果与本次试验相符合，均在OGD后立即发现线粒体裂解但不伴凋亡的发生。在本次试验中，我们持续予以OGD以寻求线粒体裂解直至发生凋亡的时间点，并且发现线粒体在OGD 60 min内裂解均不伴凋亡的发生。但是JC-1显示，在此时期线粒体膜电位持续性下降。在上述讨论中已经提到，当线粒体膜通透性增加至CytC可以通过时，CytC释放入细胞质中，触发caspase级联反应，可能在OGD 60 min内线粒体膜通透性尚不允许CytC通过。

在神经细胞中，线粒体自噬属于日常行为，此时损伤线粒体膜电位下降作为自噬位点标志，吸引相关蛋白聚集于此介导自噬[14-15]。MADINENI[16]在2016年一项研究中提及，在缺血缺氧早期阶段，Drp1依赖线粒体自噬途径即被触发，并且作为一种细胞保护作用，抑制后将导致神经细胞损伤增加。本研究发现，在OGD后30 min即有线粒体裂解，此时线粒体膜电位下降亦属于始发阶段，线粒体膜电位部分下降是否同时引起线粒体自噬而显示出线粒体裂解增加还需进一步研究。可以确定的是，线粒体裂解在OGD持续后呈现出一个连续的过程，即便此时线粒体裂解的意义已经出现了转换，但是仅从线粒体裂解过程中并不能得到体现，因为其表现形式总是裂解增加，但是线粒体膜电位下降程度或许可以部分指示线粒体可能出现的裂解意义。在60 min组，线粒体膜电位下降程度标志线粒体已经成为了细胞凋亡促进者。

文献表明，提高Drp1蛋白表达，可增加神经细胞对缺血缺氧的耐受，减少受损面积[17]。究其原因，在缺血缺氧后早期神经细胞主要发生自噬机制，作为一种细胞保护作用，此时抑制Drp1则造成损伤[18]。但是，在缺血缺氧后期，线粒体膜通透性不可避免增加，而Drp1蛋白最终也将沦为神经元凋亡的促进因素。那么，要获得提高Drp1蛋白带来的细胞保护作用，在OGD条件下，这个时间范围为60 min。