肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统EⅡC编码基因frwC缺失株的构建及表型分析

林迪斯，徐 丽，李飞雨，汪静杰，李 蓓

(湖北医药学院基础医学院，湖北十堰 442000)

肺炎克雷伯菌 (Klebsiellapneumoniae, KP)是存在于人体上呼吸道和肠道的正常菌群，可引起呼吸道、泌尿道、伤口等部位的感染，是社区获得性感染的常见菌株[1-2]。KP包含78个血清型，过去20年由KP强毒型(主要为K1、K2血清型)引起的感染如肝脓肿在全球已被证明，其死亡率可达10%～30%[3]。20世纪60年代，磷酸转移酶系统(phosphotransferase system, PTS系统)第1次在大肠杆菌中作为糖转运系统被提出，已在越来越多的细菌中被找到[4]。根据利用的糖类不同，PTS系统可分为10余种。作为一种复杂的蛋白激酶系统，PTS系统可以调节各种各样的功能运输、代谢和诱变过程及许多基因的表达[5-6]。本课题组前期研究发现，KP纤维二糖PTS系统中EⅡC蛋白编码基因celB敲除株的玻片培养粘附作用不佳，不能完成生物膜形成完整过程，并且小鼠生存率增加12.5%～87.5%[7]。通过对KP NTUH-K2044全基因组分析发现，在KP中存在一个果糖磷酸转移酶系统(KP1_1987-KP1_1993)。环磷酸腺苷受体蛋白(cAMP receptor protein, CRP)能够直接调控此系统中编码EII C蛋白的基因frwC的表达，而CRP基因缺失株细菌生长速度减慢、毒力明显下降[8-9]。在此过程中，CRP是否可以通过调控frwC的表达而影响细菌的生长与毒力？本研究通过构建frwC的缺失突变株与回补株，分析frwC对KP的生长、超黏表型、毒力的影响，从而明确CRP是否能够通过调控frwC的表达而影响其表型。

1 材料与方法

1.1菌株和质粒KP NTUH-K2044分离于肝脓肿患者，为K1血清型超黏表型，已全基因组测序。大肠杆菌DH5α及自杀质粒pKO3-km、km-pGEM-T easy质粒为本室保存。

1.2主要试剂ExTaq酶、Pfu酶、内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker为TaKaRa公司产品；细菌RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品；RNase-Free DNase试剂盒、反转录试剂盒为Promega公司产品；结晶紫为Sigma公司产品；蛋白胨、酵母粉为OXOID公司产品；NaCl、琼脂粉购自北京拜尔迪生物技术有限公司；卡那霉素购自晶美公司；氨苄青霉素钠盐(Amp)、硫酸庆大霉素(Cn)和5%绵羊血平板购自武汉天源生物技术有限公司；引物均由上海生工合成。所用引物见表1。

1.3frwC基因缺失株的构建以KP1_1992-A/B和KP1_1992-C/D引物对分别进行frwC基因的上、下游同源臂扩增。以扩增产物为模板，利用融合PCR将上下游同源臂连接，形成敲除元件。以限制性内切酶NotⅠ对融合的PCR片段和载体pKO3-km分别进行酶切，T4 DNA连接酶连接酶切产物，获得敲除用的重组质粒frwC-pKO3-km。将重组质粒电转入NTUH-K2044感受态细胞，涂布LB平板(含50 μg/mL kan)，30 ℃培养过夜。采用pKO3-km-F/R引物对鉴定已有质粒转入的阳性克隆，挑选3～5个鉴定正确的阳性单菌落，涂LB(50 μg/mL kan)平板上，43 ℃培养至平板上长出单菌落。采用KP1_1992_A/D引物对PCR扩增，筛选出产物明显小于阳性对照(KP野生株DNA为模板)的单菌落，再将此菌落接种于含蔗糖的LD平板上，挑取生长菌落，以KP1_1992-RT-F/R引物对鉴定为阴性的克隆即为KPfrwC基因的无痕缺失突变株[10]。

表1扩增所用引物列表

Tab.1 Primers used in this study

目的引物名称序列(5′→3′)构建frwC的缺失突变株KP1_1992-AGTATGCGGCCGCGTTATCGCGGCGAATGCCTCAKP1_1992-BTGACGCAGGCAGCGCTGATGCTTGCTCCTGAGCGCTGKP1_1992-CCAGCGCTCAGGAGCAAGCATCAGCGCTGCCTGCGTCAKP1_1992-DGTATGCGGCCGCGATTCGTCATGATAAACTC构建frwC的回补株KP1_1992-FGAGTCCATGGTGATAAGCAGCTGGCAGGCKP1_1992-RGAGTGTCGACATCGCTGATATTGACGCGCpGEM-T-easy质粒鉴定pGEM-T-easy-km-FGCGAATTGGGCCCGACGTCpGEM-T-easy-km-RCGCAGCCGAACGACCGAGpKO3-km质粒鉴定pKO3-km-FAATAAGCGGATGAATGGCAGpKO3-km-RTCCCTCACTTTCTGGCTGGfrwC基因RT-PCR鉴定KP1_1992-RT-FGACACAGCCCATCACCAGKP1_1992-RT-RTGCCTACGCCTTCATGCT16sRNA基因RT-PCR扩增KP1_16sRNA-RT-FATGACCAGCCACACTGGAACKP1_16sRNA-RT-RCTTCCTCCCCGCTGAAAGTAmagA基因RT-PCR引物KP1_magA-RT-FCGAAAGTGAACGAATTGATGCTKP1_magA-RT-RGTTTCTGCTGCAGATTCGAAGA

划线部分为酶切位点。NcoⅠ酶切：CCATGG ；SalⅠ酶切：GTCGAC ；NotⅠ酶切：GCGGCCGC。

1.4frwC基因回补株的构建扩增包含frwC基因编码区、上游启动区及下游转录终止区的基因片段，克隆至km-pGEM-T easy获得回补用的重组质粒frwC-km-pGEM-T easy，电转化至frwC敲除株获得frwC回补株C-frwC。

1.5frwC基因缺失株与回补株RT-PCR验证将野生株、frwC突变株、回补株37 ℃ 200 r/min培养至平台期，稀释至A600=1.2后按1∶100的比例稀释至新鲜LB培养基中，37 ℃下200 r/min培养至A=1.4，取菌液各1 mL于无菌EP管内，4 ℃ 5 000×g离心10 min，通过RNeasyR Mini kit试剂盒提取细菌RNA，RNase-Free DNase试剂盒去除DNA污染，M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒逆转录成cDNA。以cDNA为模板，16sRNA为内参基因利用frwCRT-PCR鉴定引物进行PCR扩增，15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6frwC基因对细菌生长速度的影响不同菌株接种于3 mL LB培养基中，37 ℃下200 r/min培养过夜，调整A600值约1.2后，100倍稀释接种至15 mL新鲜LB培养基中，37 ℃下200 r/min连续培养，间隔1 h取菌液测A600值，绘制生长曲线，分析不同菌株的生长速度。

1.7frwC基因对细菌毒力的影响不同菌株在LB培养基中培养至对数中期，离心收集细菌。用PBS洗涤后，104CFUs腹腔注射感染Balb/c小鼠(10只/组)，观察记录动物的死亡情况，绘制小鼠生存曲线。

1.8frwC基因对细菌超黏表型的影响不同菌株接种于3 mL LB培养液中，37 ℃培养过夜，调整A600至1.2，1∶100稀释接种于15 mL培养至A6001.4～1.6。各取1 mL菌液，10 000×g离心3 min，观察细菌沉淀情况。

1.9RT-PCR检测frwC对细菌超黏相关基因magA的影响不同菌株37 ℃ 200 r/min过夜培养，稀释A600至1.2后，按1∶100的比例接种LB培养基中，37 ℃下200 r/min培养至A600=1.4，取菌液各1 mL于无菌EP管内4 ℃ 5 000×g离心10 min，提取细菌RNA，16sRNA为内参基因，分析不同菌株超黏相关基因magA的表达情况。

1.10统计学分析采用SPSS 17.0软件分析实验数据。采用重复测量数据的组间差别多重比较LSD法检验3组细菌的生长情况；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1成功构建frwC缺失突变盒成功获得frwC基因上游581 bp及下游534 bp的同源臂。再以上下游同源臂片段的PCR产物作为模板，用引物对KP1_1992-A/D进行PCR扩增，得到长度为1 097 bp的frwC基因同源臂融合片段。同时，以野生株作为阳性对照，可得到2 028 bp的片段。PCR结果如图1所示。PCR产物大小与预期值一致，PCR产物送至上海生工测序，测序结果与基因序列一致。

图1同源臂及融合片段扩增PCR产物

Fig.1 The PCR identification results of fusion fragments

M：DL2000 marker；1：frwC上游同源臂片段；3：frwC下游同源臂片段；5：融合PCR产物；7：野生株AD长度；2、4、6、8：阴性对照。

2.2frwC缺失株的筛选及确认将构建好的frwC突变盒电转至野生株中，经过2次同源重组，获得frwC缺失突变株。分别以KP1_1992-A/B、KP1_1992-C/D、KP1_1992-A/D、KP1_1992-RT-F/R引物对进行鉴定。野生株中AD长度为2 028 bp，敲除株中为1 097 bp；野生株中frwC基因为阳性，突变株中frwC基因为阴性，各引物扩增PCR产物大小与预期值一致(图2)。

图2frwC缺失株PCR鉴定结果

Fig.2 The PCR identification results offrwCdepletion mutant

M：DL2000 marker；1、2、3：引物对为KP1_1992-A/B；4、5、6：引物对为KP1_1992-C/D；7、8、9：引物对为KP1_1992-A/D；10、11、12：引物对为KP1_1992-RT-F/R；1、4、7、10：模板为野生株；2、5、8、11：模板为突变株；3、6、9、12：阴性对照。

2.3frwC基因缺失株与回补株RT-PCR验证提取野生株、frwC缺失株及回补株的RNA，逆转录成cDNA，以16sRNA为内参，KP1_1992-RT-F/R引物对扩增，分析不同菌株中frwC基因mRNA表达情况。如图3所示，RT-PCR在野生株与回补株中能够检测到frwC基因的表达，而突变株中无frwC基因表达，说明突变株中frwC基因被成功敲除，回补株中frwC基因成功回补。

图3KP野生株、frwC基因缺失株及回补株RT-PCR鉴定

Fig.3 The RT-PCR identification results ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044frwCdepletion mutant and complementation strain

2.4frwC基因影响细菌生长速度绘制不同菌株在LB中的生长曲线(图4)，通过重复测量数据的组间差别多重比较LSD法检验发现，野生株与回补株的生长曲线差异无统计学意义(P=0.791)，敲除株与野生株生长曲线有统计学意义(P<0.05)，因此，敲除株生长速度与野生株相比明显减慢。

图4KP野生株、frwC基因缺失株与回补株的生长曲线

Fig.4 Growth curve ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044,ΔfrwCand C-frwC

2.5frwC基因敲除株小鼠实验毒力减弱我们通过小鼠腹腔感染模型分析frwC基因缺失后对KP毒力的影响，在104CFU浓度下，Kaplan-Meier法检验frwc敲除株与野生株生存率，差异有统计学意义(P=0.011)，frwC基因缺失株的存活率相对野生株明显增加(图5)，说明frwC基因敲除株的小鼠毒力明显下降。

图5KP野生株、frwC基因缺失株与回补株小鼠存活率

Fig.5 Mouse survival ofKlebsiellapneumoniae NTUH-K2044,ΔfrwCand C-frwC

2.6frwC基因敲除株黏性增强如图6A所示，10 000×g离心3 min后，野生株与回补株聚集在管底，而敲除株细菌呈云雾状分散于EP管下端。随后RT-PCR检测超黏基因magA表达发现，敲除株的表达量多于野生株与回补株，frwC基因敲除株黏性增强。

图6超黏表型实验

Fig.6 Biosynthesis test of capsular polysaccharide

A：离心实验；B：RT-PCR。

3 讨 论

1964年，KUNDIG等[4]发现了磷酸转移酶系统，提出PTS可能会催化糖转运及糖磷酸化。PTS转运系统由EI、HPr与EⅡ(一般包含3或4个结构域A、B、C或D)三类蛋白质构成。其中EⅡC一般位于细胞膜上，能特异识别糖并将其转运至细胞内，因此决定了PTS系统糖转运的特异性[5,11-12]。且越来越多的证据表明，PTS已经不只是参与糖类的代谢转运，还存在很多不同的种类，例如，李斯特菌中主要的毒力调控子PrfA的活性与PTS系统组件的磷酸化状态相关[13]；在布鲁氏菌毒力相关基因的筛选中发现，PTS相关基因ptsN和ptsH缺失导致细菌毒力减弱[14]。

在对于KP的研究中，有研究发现，敲除编码纤维二糖酶Ⅱ(EⅡC)特异性亚基ⅡC的celB基因后，缺失株的的生物膜形成能力及细菌毒力均低于野生株[7]。除纤维二糖PTS系统外，KP还有10多种PTS系统。其中KP1-1987-KP1-1993基因编码果糖磷酸转移酶系统。

本课题组在研究CRP蛋白对KP的毒力影响及机制中发现，CRP能够直接调控果糖磷酸转移酶系统EⅡC蛋白编码基因frwC的合成。在创伤弧菌中，毒力因子vIDE的表达由CRP蛋白和葡萄糖PTS系统共同作用[15]。那么在KP中CRP是否通过调节frwC的表达来影响细菌生长、超黏表型及毒力，frwC是否与细菌的致病性相关？本研究通过构建frwC基因的缺失株及回补株分析frwC基因在KP生长、超黏表型及毒力中的作用。通过细菌生长曲线实验证明frwC基因影响细菌生长速度；通过离心实验发现frwC基因敲除株的超黏性升高；超黏基因magA表达量检测与离心实验结果相符，说明frwC敲除后细菌黏性增强；小鼠毒力实验发现frwC也与毒力密切相关，frwC基因敲除株细菌毒力明显下降。

通过研究发现，frwC作为果糖磷酸转移酶系统EIIC的编码基因，能够影响细菌的生长、超黏表型及毒力。因此，果糖PTS系统不仅参与了糖类的利用，它还能影响细菌的其他功能。crp基因缺失突变株同样毒力、生长速度下降，而且超黏性增加，说明CRP除调控细菌荚膜、菌毛等毒力因子外，还能通过影响frwC的表达而调控细菌毒力。