牛栏山二锅头大茬酒醅发酵过程中细菌群落结构分析

胡佳音,周 森,王 瑛,赵卫鹏,朱婷婷,魏金旺*

(北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂,北京 101301)

牛栏山二锅头属于清香型白酒,其酿造过程是开放式的多菌种固态发酵,以高梁等谷物为原料,大曲为糖化发酵剂,采用清蒸清茬、固态地缸发酵、清蒸流酒[1]的酿造工艺,开放式的酿造方式使其网罗自然界的多种微生物,形成了专属牛栏山二锅头的独特菌群。

在白酒酿造中细菌是不可或缺的一类微生物,其往往具有数量较多、种类丰富等特点,常被认为是“生香动力军”[2]。在牛栏山二锅头酿造过程中,细菌主要分为乳酸菌、芽孢杆菌和放线菌三大类群[3]。目前,对白酒微生物的研究方法主要分为传统微生物分离和微生物非培养方法,传统微生物分离是白酒微生物研究中较为常用的技术手段,它主要适用于发酵中可培养类微生物,可以有效地确定微生物数量的变化规律并获得活体菌株,如王庆宇等[4]采用多种培养基对老白干制曲过程中多种培养基进行微生物分离,确定不同培养基对大曲中一般性细菌、乳杆菌、乳球菌、霉菌、酵母菌具有较好的分离效果。近几年来,随着分子生物学技术的快速发展和在复杂环境微生物群落结构分析中的应用,基于现代分子生物技术的微生物非培养方法研究逐渐成为热点[5],如高亦豹等[6]利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerasechain reaction-denaturinggradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)方法分析了我国白酒高温和中温大曲细菌群落结构,得出不同工艺大曲细菌群落结构存在明显差异;唐婧等[7]利用高通量测序分析了茅台酒曲微生物多样性,确定了茅台大曲中的细菌组成;邓杰等[8]利用高通量测序技术分析了浓香型白酒窖池窖泥细菌群落结构,建立了一套完整的窖泥微生物群落结构研究方法并获得不同窖龄窖泥微生物群落结构。

本研究利用传统微生物分离和高通量测序技术相结合的方法,分析了牛栏山二锅头大茬酒醅发酵过程中细菌结构的变化。确定了酿造过程中细菌的变化规律及优势微生物,为清香型白酒优良细菌微生物的筛选及其功能性研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

牛栏山二锅头大茬酒醅:牛栏山酒厂冬季第一次入缸发酵的高粱。

1.1.2 试剂

三氯甲烷、异戊醇、异丙醇(均为分析纯):上海生工生物工程有限公司;Fast DNA SPIN Kit for Soil(MPbio土壤基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取试剂盒):北京比特博生物技术有限公司。

1.1.3 培养基

乳酸菌分离培养基:采用乳酸细菌(MRS)培养基。牛肉膏10 g,酪蛋白胨30 g,酵母提取物5 g,葡萄糖20 g,乙酸钠5g,柠檬酸氢二胺2g,吐温801 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,K2HPO42 g,MnSO4·H2O 0.25 g,萘啶酮酸50 mg,琼脂15 g,蒸馏水1 L。

芽孢杆菌分离培养基:采用肉汁(nutrient broth,NB)培养基。蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,琼脂15 g,蒸馏水1 L。

放线菌分离培养基:采用链霉菌培养基2号(ISP2)培养基。酵母提取物4 g,麦芽提取物5 g,D-葡萄糖4 g,萘啶酮酸50 mg,琼脂18 g,蒸馏水1 L,pH 7.3。

细菌基础培养基:采用LB培养基。胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化钠10 g,蒸馏水1 L。

以上培养基均在121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜:北京东联哈尔仪器制造有限公司;C1000快速梯度基因扩增仪、基础型水平电泳仪、全自动凝胶成像仪:美国BIORAD公司;1-14k高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司;SPX-320型生化培养箱:宁波江南仪器厂;MPFastPrep-24样品快速制备系统:美国MP公司;L95系列智能温度记录仪:上海发泰精密仪器表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大茬酒醅发酵温度曲线的测定

将温度记录仪探头埋入地缸中心点,距地缸表面60 cm处,记录大茬酒醅发酵过程中温度的变化过程。

1.3.2 大茬酒醅细菌分离

取样:根据大茬酒醅发酵温度曲线的特点,从整个发酵周期28d中确定6个时间点采集样品,选取同批次发酵的三缸作为取样缸(平行样品),标记为A缸、B缸、C缸,入池0 d的样品乃取一份,其余5份样品取样位置为地缸中心点与缸壁之间,距地缸表面60 cm深处,样品编号为D5A、D5B、D5C(D5代表取样时间),其余取样点以此类推。

分离:分别称取不同酿造时间的酒醅样品10g于90 mL无菌水中稀释,拟定为10-1梯度。依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5梯度,根据发酵时间吸取不同梯度稀释液0.1 mL涂布于相应培养基平板。分离方法及培养条件如表1所不。

表1 大茬酒醅中微生物的分离培养基及方法Table1 Isolation mediums and methods of microorganisms in Dacha fermented grains

计数:培养时间根据菌落的生长情况而定,一般为24～48 h,一般选择菌落数在20～300 CFU/mL之间的平板进行计数。在这个范围之外则不能正确地指不样品中微生物的真实数量。具体计数原则如下:

为了避免虚假精确度的产生,当进行活菌计数时,保留一位有效数字,按照四舍五入原则对其进行取舍。每毫升菌落形成的单位(colony formingunit,CFU)=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×10,根据稀释倍数统计不同培养基中微生物的种群数量,获得发酵过程中细菌微生物数量变化规律[9]。

1.3.3 大茬酒醅高通量测序

(1)大茬酒醅总DNA的提取

分别称取不同发酵时期的大茬酒醅样品1 g,用快速样品制备系统(Fastprep)处理后,采用MPbio土壤基因组DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil)提取不同发酵时期大茬酒醅的基因组。

(2)大茬酒醅的高通量测序

所提DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后,送往北京奥维森公司,利用IlluminaMiSeq对细菌的16SrDNA V3/V4区序列进行高通量测序,测序引物为正向引物:5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';反向引物:5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。原始测序序列通过软件Fastqc进行质量检测去除低质量Reads(过滤标准:Q20≥90%)。通过(connectingoverlappedpair-end,COPE)软件进行序列拼接、过滤。利用Mothur软件以平均邻近聚类算法(average neighbor clusteringalgorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下对Clean Tags进行操作分类单元(operationaL taxonomic units,OTU)的聚类,统计每个样品每种OTU中的丰度信息。选取分析数据中每个OTU中一个有代表性的序列进行Blast比对,获得每一个OTU所代表的种名[10-12]。

2 结果与分析

2.1 大茬酒醅发酵温度曲线

大茬酒醅的发酵温度曲线如图1所不。

图1 大茬酒醅发酵温度曲线及取样点Fig.1 Fermentation temperature curve of Dacha fermented grains and sampling points

由图1可知,酒醅升温曲线较为理想,呈现前缓升、中挺、后缓落的趋势,即0～9 d属于温度前缓升阶段,温度的缓慢上升利于控制微生物生长速度,防止酒醅生酸过猛,维持正常发酵的进行;9～13 d为中挺阶段,温度较为稳定,是前缓升阶段和后缓落阶段的交接期;13～28 d为后缓落期,温度缓慢降低,该阶段酒精发酵基本结束,主要以生香为主。因此本研究所选取的6个取样点分别为0 d、5 d、9 d、13d、19d、28d,涵盖了发酵的3个阶段,具有较好的代表性[13]。

2.2 大茬酒醅细菌数量变化规律

分别对发酵过程中乳酸菌、芽孢杆菌、常规细菌和放线菌4类细菌进行数量跟踪,其中放线菌数量较少,仅在入池0 d和13d稀释梯度为10-1的样品中分离检测到,不具备规律性,所以本研究乃讨论发酵过程中乳酸菌、芽孢杆菌和常规细菌变化规律,结果见图2。

由图2可知,在入池阶段,酒醅中含有大量的乳酸菌(10.6 lg(CFU/g)),远高于芽孢杆菌(5.8 lg(CFU/g))和常规细菌(5.7 lg(CFU/g)),是入池阶段的主要细菌。随着发酵的进行,在缓升阶段(0～9 d),乳酸菌快速增长,菌落总数由10.6 lg(CFU/g)增长至14.5 lg(CFU/g);在中挺阶段(9～13 d)及后缓落期(13～28 d),乳酸菌数量仍缓慢增长,在发酵19d时,乳酸菌数量达到最高值,为15.53lg(CFU/g);发酵28d时,乳酸菌数量出现了少量降低。入池发酵后,芽孢杆菌数量缓慢降低,发酵5 d,芽孢杆菌数由5.80 lg(CFU/g)下降至5.02lg(CFU/g);发酵5d后,芽孢杆菌数量缓慢增长,菌落总数在出池阶段达到最高值,为5.92lg(CFU/g)。常规细菌数量由入池阶段的5.71 lg(CFU/g)缓慢增长至出池阶段的最高值5.99 lg(CFU/g)。与乳酸菌相比,芽孢杆菌和常规细菌数量增长仅为0.11lg(CFU/g)和0.28lg(CFU/g),说明二锅头发酵过程中芽孢杆菌和常规细菌数量基本稳定,变化幅度较小。整体分析得出,牛栏山二锅头酒醅发酵过程中芽孢杆菌和常规细菌数量基本稳定,乳酸菌是发酵过程主体细菌类微生物。

图2 大茬酒醅发酵期间细菌数量的变化Fig.2 Changes of the bacterial population in Dacha fermented grains during fermentation process

2.3 高通量测序分析

通过高通量测序,共获得559种细菌OTU,主要包括乳杆菌科(Lactobacillaceae)、高温放线菌科(Thermoactinomycetaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)和醋杆菌科(Acetobacteraceae)。筛选出占总reads比例＞1%的微生物进行分析,结果见表2。

表2 菌种的数量比例Table2 Proportion of bacteria

由表2可知,酒醅发酵过程中,占总reads比例＞1%的细菌共有14种,主要由3种类群组成,包括1种高温放线菌(Thermoactinomyces)、1种醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)和12种乳酸菌,14种细菌reads之和可占发酵过程总reads数的91.82%,因此可以确认其能够较为全面的反应大茬酒醅发酵过程中细菌类群的变化规律。

根据不同的发酵时间对14种细菌进行分析,获得发酵过程细菌多样性变化情况,结果如图3所不。

图3 基于高通量测序结果大茬酒醅中细菌物种多样性和演替Fig.3 Bacterial diversity and succession in Dacha fermented grains based on high-throughput sequencing results

由图3可知,在入池阶段(0 d),大茬酒醅中主要细菌为融合维斯氏菌(Weissella confusa)、巴氏醋酸菌(Aceto bacter pasteurianus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)和others(14种以外的细菌),说明在入池阶段,大茬酒醅中含有随大曲及环境带入的多种细菌类微生物;缓升阶段(0～9 d)是二锅头酿造的生酸阶段,在该阶段乳酸菌快速增长,戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、黑龙江乳杆菌(Lactobacillus heilongjiangensis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillusparabuchneri)和W.confusa逐渐成为了酒醅内主体细菌,乳酸菌大量增长所生成的有机酸类有助于提高酒醅的酸度,维持发酵的正常进行,也为乳酸乙酯的合成提供了前体物质;中挺阶段(9～13 d)是酒精发酵的主发酵阶段,占整个发酵周期酒精生成量的90%以上,较高的酒精含量抑制了乳酸菌的生长,使乳酸菌数量和种类维持稳定,主要以P.pentosaceus、L.heilongjiangensis、L.parabuchneri和L.brevis为主;发酵后缓落期(13～28 d)是各种香味成分相互融合、相互转化的过程,可使酒质更加醇厚绵柔,回味绵长,在该阶段酒醅中乳酸菌数量稍有增长且种类出现更替,耐酸乳杆菌(Lactobacillusacetotolerans)成为了发酵后缓落期的主体细菌类微生物,在出池样品中其可占细菌比例的71.37%～74.8%。目前,对于二锅头酒中耐酸乳杆菌的研究较少,其在酿造后缓落期的具体作用还尚不明确,还需要进一步研究[14]。

3 结论

本研究利用传统分离技术和高通量测序技术相结合的方法对牛栏山二锅头大茬酒醅发酵期间的细菌多样性进行研究,从微生物数量演替和种属多样性变化两方面,系统解析了牛栏山二锅头酒醅发酵过程中细菌群落的演替规律。研究结果表明,乳酸菌在发酵过程中,数量大量增长,在发酵的前缓、中挺、后缓落3个阶段,不同种属乳酸菌分别成为发酵过程中的优势菌,而芽孢杆菌和其余细菌数量基本维持稳定,且在高通量种属比例中占有量较低;同时,高通量数据中发现高温放线菌(Thermoactinomyces)在发酵前缓生阶段占有一定比例,且目前在清香型白酒中未见报道,仅在芝麻香高温大曲中发现[15],说明了在牛栏山二锅头酒醅酿造过程中存在一定量的高温类放线菌类群,而其在发酵过程中的具体作用,还需进一步分析验证。