γ射线辐照预处理玉米秸秆发酵产乙醇的研究

张 勇,郭栋豪,王克勤,武小芬,齐 慧,邓 明,陈 亮*

(1.湖南省农业科学院 湖南省核农学与航天育种研究所,湖南 长沙 410125;2.湖南省农业生物辐照工程技术研究中心,湖南 长沙 410125;3.湖南大学 隆平分院,湖南 长沙 410125)

我国是农业大国,农业生产每年都产生数量丰富的秸秆生物质。据统计,2016年全国农作物秸秆产量为8.16亿t,其中玉米秸秆的产量最大,占总量的36.88%[1]。目前秸秆综合利用水平和效率还比较低,主要集中在肥料化、燃料化、饲料化方面。随着经济与社会的发展,秸秆的传统利用方式在逐渐萎缩,秸秆资源处于严重相对过剩状态,秸秆露天焚烧事件屡见不鲜,给生态环境带来巨大压力,因此为秸秆利用寻求新的途径迫在眉睫。

与此同时,在传统化石能源日益枯竭的背景下,将数量巨大的秸秆类木质纤维素转化为生物质能源越来越引起人们的兴趣[2]。很多国家从20世纪70年代左右就已经开始了以可再生资源作为补充替代能源的研究[3]。预处理是秸秆等木质纤维素炼制生物质能源的关键技术瓶颈之一。有效的预处理能破坏秸秆的物理化学结构,有助于提高秸秆的转化效率,但同时增加预处理工序又会提高生产成本,还可能因为预处理过程使用的酸碱化合物而造成环境污染,因此能否达到多方面的平衡成为评价预处理方法是否可行的重要依据。γ射线辐照是一种很有特色木质纤维素的预处理手段,与常见的预处理方法比较,秸秆在辐照预处理时无需水的参与,也不需要添加酸碱等化合物,因此无环境污染的顾虑,并且辐照处理过程是在常温下进行,因此能耗低,最关键的是经过辐照处理后,秸秆的糖化效率可以数倍的提高[4-5]。但是关于辐照预处理木质纤维素的研究大多集中在酶解糖化阶段[6-7],对后续发酵产乙醇工艺研究较少。因此,以γ射线辐照为预处理手段,探讨玉米秸秆酶解发酵产乙醇的一些基本问题,可以为玉米秸秆炼制燃料乙醇提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米秸秆:2016年10月采集于湖南省作物研究所试验田。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):中国工业微生物菌种保藏管理中心(china center of industrial culture collection,CICC)31014。

香草酸、丁香酸、香草醛、对香豆酸(均为色谱纯):德国Sigma公司;甲酸、乙酸、糠醛、对羟基苯甲酸、4-羟基苯甲醛、无水葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、乙腈、甲醇、无水乙醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、硼氢化钠、硫酸、磷酸氢二铵、无水氯化钙、氢氧化钙、氢氧化钠(均为分析纯):国药集团化学试剂有限公司;酵母粉(生化试剂):广东环凯微生物科技有限公司;纤维素酶(40FPU/mL):Novozymes公司。

发酵培养基:硫酸铵2 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、无水硫酸镁1 g/L、无水氯化钙0.2 g/L、酵母粉5 g/L;pH≈6(碳源为玉米秸秆)。121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

60Co-γ辐照装置:湖南省核农学与航天育种研究所;Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC):赛默飞世尔科技(中国)有限公司;TG16-Ⅱ台式高速离心机:长沙平凡仪器仪表有限公司;YXQ-LS-50S11压力蒸汽灭菌器:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HZQ-F100恒温摇床:常州诺基仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米秸秆辐照处理

玉米秸秆在60℃条件下烘干,切成5 cm左右的小段,装入金属样品盒,于室温条件下用60Co-γ射线进行辐照预处理,辐照剂量率为1.25 kGy/h。

1.3.2 玉米秸秆脱毒处理与发酵

脱毒处理:分别称取吸收剂量约800 kGy、绝干质量为10 g的辐照玉米秸秆粉于250 mL的具塞锥形瓶中,分三组分别加入100 mL去离子水、100mL氢氧化钙溶液(pH=11)、100 mL 20 mmol/L硼氢化钠溶液,然后置于恒温摇床中,37℃、150 r/min条件下处理2 h,结束后取出过滤。

乙醇发酵:取100 mL发酵专用具塞锥形瓶,分别加入1.5 g的上述3种脱毒处理所得样品滤渣,灭菌后加入27 mL发酵培养基,再按20 FPU/g固体加入纤维素酶,最后加入3 mL种子培养液,置于恒温摇床中,37℃、150 r/min条件下进行同步糖化发酵(simultaneous saccharification and fer mentation,SSF)。

1.3.3 玉米秸秆在不同工艺条件下的乙醇发酵

玉米秸秆的酶解:向锥形瓶中加入pH 5.0左右的发酵培养基45 mL和吸收剂量约800 kGy、绝干质量为5 g的辐照玉米秸秆粉,置于高压灭菌锅中,121℃灭菌20 min,冷却后按20 FPU/g固体加入纤维素酶。

玉米秸秆的发酵:同步糖化发酵,在加入纤维素酶时同步加入酿酒酵母,发酵温度为37℃;分步糖化发酵(sepa rate hydrolysis and fermentation,SHF)则是在50℃振荡酶解48 h后再接入酿酒酵母,发酵温度为37℃;变温同步糖化发酵(nonisothennal simultaneous saccharitlcation and fermentation,NSSF)是在加入纤维素酶时同步加入酿酒酵母,于37℃条件下发酵,期间每发酵12h便将温度升至42℃保持20 min,之后在37℃条件下继续发酵,如此反复直至发酵结束;半同步糖化发酵(hemi simultaneous saccharification and fermentation,HSSF)是在50℃条件下酶解12 h后再接入酿酒酵母发酵,发酵温度为37℃。所有发酵实验的酵母接种量均为10%。

1.3.4 测定方法

木质纤维素含量:按照参考文献[8]的方法进行测定;纤维素酶酶活:按照参考文献[9]的方法进行测定;单糖、乙醇含量:按照参考文献[10]的方法进行测定;抑制物含量:按照参考文献[11]的方法进行测定。

乙醇转化率按下式计算:

2 结果与分析

2.1 不同辐照处理强度对玉米秸秆化学及物理性质的影响

表1 辐照对玉米秸秆主要化学组分的影响Table1 Effect of irradiation on main chemical constituents of corn straw

从表1可以看出,玉米秸秆经过辐照后,3种主要化学组分的含量都不同程度的降低,说明γ射线对玉米秸秆的3种主要化学组分都有降解作用,且在实验范围内,3种组分含量与辐照强度呈负相关,说明辐照强度越大,这3种化学组分降解越严重,孙丰波[12]在用γ射线辐照竹材时也发现该现象,本课题组之前在研究γ射线辐照对水稻秸秆化学组分时还发现辐照在降低水稻秸秆木质纤维素含量的同时会使秸秆的可溶性糖大幅度提高[13],因此辐照后玉米秸秆纤维素、半纤维素含量的大幅度降低并不意味着糖的大量损失,而可能意味着大分子的纤维素、半纤维素被降解成较低分子量的糖;3种化学组分对辐照的敏感程度不一,木质素含量变化最小,说明对辐照最稳定,半纤维素含量变化最大,说明最容易被降解,这可能与其化学结构的稳定性有关,木质素是由苯环类化合物组成,结构稳定,因此难降解,而半纤维素属于杂多糖,且侧链较多,结构稳定性差,因此容易被降解[14]。

玉米秸秆经不同辐照剂量处理后表观结构的变化情况见图1。

图1 辐照对玉米秸秆表观结构的影响Fig.1 Effect of irradiation on apparent structure of corn straw

从图1可以看出,未经辐照的玉米秸秆表观结构相对平滑、完整,辐照后的玉米秸秆微观结构变的粗糙多孔,说明辐照对玉米秸秆的微观结构有明显的破坏作用,在水稻、芒草、芦苇秸秆中发现过类似现象[13,15-16]。这种疏松多孔结构增加了玉米秸秆的表面积,有利于秸秆生物炼制过程中酶与底物接触,提高酶解转化效率。

2.2 不同脱毒处理对辐照玉米秸秆乙醇发酵的影响

由于预处理是将木质纤维素原有物理化学结构破坏并重组的过程,因此不可避免的会生成新化合物,其中就包括抑制发酵的物质,并且预处理方式、原料种类对抑制物的生成都有影响[17]。经过辐照处理的玉米秸秆在水洗、氢氧化钙和硼氢化钠脱毒处理后,脱毒滤液中部分抑制物的浓度情况见表2,滤液中抑制物含量越高,则残渣中抑制物含量越小,脱毒处理对抑制物脱除效果越好。

有机酸是木质纤维辐照处理过程中最常见的副产物,也是一类常见的发酵抑制物,由表2可知,氢氧化钙处理对甲酸的脱除效果最佳,约为水处理的2.5倍;氢氧化钙和硼氢化钠对乙酸脱除效果相当,都明显优于水处理,对于其他有机酸,除对香豆酸外,3种处理差别不是非常明显;而对于另一种强发酵抑制物糠醛,氢氧化钙和硼氢化钠处理的脱除率约为水的2倍,但是3种处理液中糠醛的含量都不高,可能是木质纤维素辐照过程中糠醛生成量较少的原因。

表2 不同脱毒处理对脱除抑制物效果的影响Table2 Effect of different detoxification treatments on detoxification inhibitors effect

图2 不同脱毒处理对辐照玉米秸秆乙醇转化率的影响Fig.2 Effect of different detoxification treatments on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由图2可知,三种脱毒方式处理后发酵72 h时乙醇转化率均基本达到最大值。三种脱毒处理玉米秸秆乙醇转化率大小顺序为:硼氢化钠处理(73.6%)＞氢氧化钙处理(70.8%)＞水洗(66.7%),均显著高于未脱毒处理玉米秸秆乙醇转化率(56.0%)(P＜0.05)。因此,脱毒处理对提高辐照玉米秸秆乙醇转化率有明显作用。

2.3 不同发酵工艺对辐照玉米秸秆乙醇发酵影响

图3 不同发酵工艺对辐照玉米秸秆乙醇转化率的影响Fig.3 Effect of different fermentation processes on ethanol conversion rate of irradiated corn straw

由于不同预处理方法的作用原理及作用效果都不相同,加上不同原料的化学成分、物理性质也不相同,因此可能导致后续的酶解发酵工艺可能需要根据实际情况进行优化[18],选择合适的酶解发酵工艺是工艺条件优化的第一步。由图3可知,经过辐照的玉米秸秆都能发酵获得乙醇,并且发酵24h后乙醇转化率都接近或达到最大值,发酵完成时间和单糖发酵产乙醇时间相当,发酵效率比较高,主要原因是秸秆中大分子纤维素和半纤维素在辐照后已经被降解成小分子多糖,多糖水解为单糖的速率大大加快;SHF、NSSF、HSSF和SSF的乙醇转化率分别为41.9%、41.9%、39.6%和55.9%,可以看出前3种工艺的乙醇转化率差异不大,而SSF获得的乙醇转化率较另外3种工艺高,说明对于玉米秸秆而言,SSF与辐照预处理的适配性比较好。

3 结论

本实验对射线辐照处理玉米秸秆进行了发酵产乙醇研究,发现γ射线辐照能破坏玉米秸秆物理化学结构,但同时发现在辐照后的玉米秸秆中存在甲酸、乙酸、糠醛、对羟基苯甲酸、四羟基苯甲醛、对香豆酸等发酵抑制物,脱毒处理能降低抑制物浓度并显著提高乙醇转化率(P＜0.05),其中硼氢化钠脱毒后的玉米秸秆乙醇转化率最高,为73.6%;初步研究了发酵工艺与辐照预处理的适配性,发现SSF与γ射线辐照预处理的玉米秸秆适配性最好,该工艺下辐照玉米秸秆乙醇转化率为55.9%。