诺丽酵素抗氧化性能与蛋白质营养价值评价研究

陈小伟,程勇杰,薛淑龙,方 晟,张 婷,崔艳丽,毛建卫,沙如意*

(1.浙江科技学院 生物与化学工程学院 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室 浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江 杭州 310023;2.绍兴文理学院 元培学院,浙江 绍兴 312000;3.浙江大学 化学系,浙江 杭州 310027)

诺丽(noni)又名海巴戟、诺尼,属茜草科(Rubiaceae),主要分布于南太平洋诸多岛屿和菲律宾等,在我国海南省、台湾省和西沙群岛地区也有分布[1]。诺丽果中含有丰富的蒽醌类、黄酮类、萜类、苯丙素类、糖苷类等生物活性物质[2-3],具有抗氧化[4]、保护心肌细胞[5-6]、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、镇痛、降压和抗炎等多种功效。诺丽汁对肝脏损伤具有一定的保护作用[7]。

食用植物酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海藻类、食药两用本草类等食材为原料,加(或不加)糖类物质,经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品。植物酵素包含了植物本身的有效成分,经过微生物长时间的发酵,部分难以利用或无法利用的物质被降解为小分子物质,微生物的次级代谢产物及一些小分子成分能更好的被机体吸收和利用[8-10]。诺丽经发酵制备诺丽酵素的过程中,蛋白质、多糖等大分子物质逐渐被降解成容易吸收的氨基酸、肽类、寡糖、单糖等小分子组分。本研究对不同发酵时间诺丽酵素中的总酚、氨基酸、蛋白质等成分含量进行检测,探索总酚和抗氧化能力之间的相关性,同时采用氨基酸比值系数法对诺丽酵素中的蛋白质营养价值进行评价,分析得出最符合人体蛋白质营养需求的较佳发酵时期,以期为科学地指导诺丽酵素的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不同发酵时间(360 d、450 d、720 d)的诺丽酵素发酵液:海南某企业提供;1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;2,2-联氮基-双-二胺盐[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]:上海长哲生物科技有限公司;三氯乙酸、没食子酸、蒽酮(均为分析纯),一水合柠檬酸、柠檬酸钠、冰乙酸、重蒸酚(均为优级纯):国药集团化学试剂有限公司;γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、混合氨基酸标准溶液(标准品):日本和光纯药工业株式会社。

1.2 仪器与设备

PTX-FA210型电子天平:福州华志科学仪器有限公司;PHS-3C型精密酸度计:杭州齐威仪器有限公司;N-1100SW/N-1100SF-W型斜式旋转蒸发仪:东京理化器械株式会社;UV-5500PC型紫外分光光度计:上海市元析仪器有限公司;JT-DCY-12Y型水浴氮吹仪:杭州聚同电子有限公司;L-8900氨基酸分析仪:日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 总酚含量的测定

采用福林酚(Folin-Phenol)法[11]测定诺丽酵素发酵液中总酚含量。

标准曲线的绘制:准确配制100μg/mL、200μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、700 μg/mL的不同质量浓度没食子酸标准溶液。分别取0.5 mL标准溶液,加入10%(V/V)Folin-Phenol溶液2.5mL,充分振荡混匀,在常温下避光静置3 min。反应结束后加入7.5%Na2CO3溶液2 mL,振荡混匀,25℃、120 r/min避光反应1 h,以0.5 mL水作为空白调零,于波长765 nm条件下测定吸光度值。

样品总酚含量的测定:取3种不同发酵时间的诺丽酵素发酵液,加水稀释25倍,取0.5 mL稀释液,参照曲线绘制方法测定总酚含量。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

参考SHARMA OP等[12]的方法,并略有改进。分别取5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL的不同发酵时间的诺丽发酵液于10 mL洁净干燥的离心管中,加入去离子水补足至2 mL,再分别加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液,置于25℃恒温水浴中反应30 min,本底管中DPPH-甲醇溶液用甲醇取代。以去离子水调零,0.5 mg/mL维生素C(vitamin C,VC)作阳性对照,在波长517 nm条件下,检测样品吸光度值,DPPH自由基清除能力计算公式如下:

式中:A0为以去离子水为参比溶液的吸光度值,A1为样品吸光度值,A2为本底管的吸光度值。

1.3.3 ABTS自由基清除能力的测定

参考OZGENM等[13]的方法,并略有改进。用5mmol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer solution,PBS),将加入过硫酸钾的ABTS稀释到7 mmol/L,得到最终浓度为2.45 mmol/L的ABTS-PBS溶液,在暗处室温放置12～16 h。在波长734nm处,使用前用PBS缓冲液将ABTS溶液稀释至吸光度值0.70±0.02。

分别取1μL、2μL、3μL、4μL、5μL、6μL的诺丽酵素于10 mL洁净干燥的离心管中,用5 mmol/L pH 7.4 PBS溶液补足至300μL,加入5 mL上述ABTS-PBS溶液,30℃条件下反应1 h,本底管中稀释过的ABTS-PBS用PBS取代。以PBS调零,4 mg/mL维生素C(vitamin C,VC)作为阳性对照,在波长734 nm条件下检测样品吸光度值,ABTS自由基清除能力计算公式如下:

式中:A0为以去离子水为参比溶液的吸光度值,A1为样品吸光度值,A2为本底管的吸光度值。

1.3.4 Fe3+还原力的测定

参考YILDIRIM A等[14]的方法并略有改进。取15μL、30μL、45μL、60μL、75μL的不同发酵时间的样品于10mL洁净干燥的离心管中,加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.6)补足至2.5 mL。再加入1%铁氰化钾水溶液2.5 mL,混合均匀,于50℃恒温水浴锅中反应30 min。反应结束加入10%三氯乙酸水溶液2.5mL,混匀,避光静置10min。取2.5mL上清液加入含有2.5mL去离子水的洁净离心管中,加入0.1%三氯化铁水溶液0.5mL,混匀。以去离子水调零,0.5mg/mLVC作为阳性对照,在波长700 nm条件下,检测样品吸光度值。

1.3.5 可溶性蛋白质含量分析

采用考马斯亮蓝G250法测定诺丽酵素中的可溶性蛋白质含量[15]。

1.3.6 氨基酸含量测定

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》检测诺丽酵素中氨基酸的含量[16]。采用L-8900氨基酸分析仪,以柠檬酸钠缓冲溶液为流动相;流速:0.4mL/min;分离柱柱温:57℃;反应柱柱温:135℃;进样量:20μL;检测波长:一通道570 nm,二通道440nm。诺丽酵素样品稀释25倍后,以峰面积作为检测指标,采用外标法计算氨基酸含量。

1.3.7 氨基酸评分

通过测定不同发酵时间诺丽酵素发酵液中各种氨基酸的含量,采用联合国粮农组织(food and agriculture organization of theunited nations,FAO)和世界卫生组织(world healthorganization,WHO)提议的必需氨基酸模式评价蛋白质的营养价值,计算样品中的氨基酸得分(aminoacid score,AAS)与必需氨基酸的比值(ratio of amino acid,RAA),其中AAS值越接近于100%,蛋白质营养价值越高。氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid,RC)主要用于表征样品中氨基酸含量与模式中氨基酸含量相对偏离的程度,RAA及RC的数值越趋向1,则表不该样品的氨基酸越接近WHO/FAO的推荐值;氨基酸比值系数分(score of ratio coefficient of amino acid,SRC)作为另外一种评判营养价值的指标,其值越接近100,表明该样品中必需氨基酸的含量越均衡,营养价值就越高。其计算公式如下:

1.3.8 数据统计和分析

各个时间点不同指标的测定,实验重复次数n=3,数据统计和分析采用SPSS18.0软件,显著性分析采用方差方法。

2 结果与分析

2.1 诺丽酵素总酚含量与抗氧化性能评价

根据不同质量浓度没食子酸水溶液制作的标准曲线,结果见图1。由图1可知,吸光度值与没食子酸质量浓度呈现出良好的线性关系,线性方程y=0.0096x+0.0256,相关系数R2=0.9992。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Standard curve of gallic acid

不同发酵时间诺丽酵素发酵液中总酚含量如图2所不。由图2可知,随着发酵时间的延长,总酚含量有轻微的增加,但提高并不显著(P＞0.05)。可能是因为诺丽果中的总酚会降解成单体酚,另一方面,微生物的代谢作用也会产生新的酚类物质。蒋增良等[17]的研究中也发现葡萄酵素发酵过程中总酚含量在发酵过程中有较为明显的上升,可能是因为大分子酚类物质分解成小分子酚类物质,导致总酚含量提高。

图2 不同发酵时间诺丽酵素总酚含量Fig.2 Total phenolic content of noni Jiaosu with different fermentation time

2.1.1 DPPH自由基清除能力的评价

以0.5 mg/mL VC为参照物,对不同发酵时间的诺丽酵素DPPH自由基清除能力进行评价,结果如图3所不。由图3可知,随着加样体积的增加,对DPPH自由基的清除能力呈现较强的浓度依赖性,且表现出良好的线性关系,经拟合,不同发酵时间诺丽酵素发酵液加样体积和DPPH自由基清除能力的线性相关系数分别为0.997 5、0.995 3和0.989 2。不同发酵时间诺丽酵素在加样量为30μL时,对DPPH自由基清除率均在65%左右,但不同发酵时间的抗氧化性能并无显著性差异(P＞0.05)。发酵360 d、540 d和720 d的诺丽酵素半抑制浓度(half maximal inhibitoryconcentration,IC50)分别是0.684 mg VC/mL、0.698 mg VC/mL、0.667 mg VC/mL,对DPPH自由基清除能力从大到小依次是:VC(0.5mg/mL)＞720d诺丽酵素＞360d诺丽酵素＞540d诺丽酵素。

图3 诺丽酵素对DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging ability of noni Jiaosu

2.1.2 ABTS自由基清除能力的评价

不同发酵时间诺丽酵素发酵液对ABTS自由基清除能力见图4。由图4可知,不同发酵时间诺丽酵素发酵液均表现出很强的ABTS自由基清除能力。发酵360d、540d和720d的诺丽酵素IC50分别为:3.453 mg VC/mL,3.493 mg VC/mL,3.937 mg VC/mL,ABTS自由基清除能力从大到小依次是:360 d诺丽酵素＞540 d诺丽酵素＞720 d诺丽酵素＞VC(4 mg/mL)。

式(2)约束条件表示变电站第N条馈线的最大负荷fN必须小于等于与之相联络且负荷裕度最大的两条馈线的负荷裕度之和。因现场实际倒闸规范要求，这里暂只考虑两条相联络线路，不考虑3条以上联络线路的情况。

2.1.3 Fe3+还原力的评价

以不同发酵时间诺丽酵素样品质量浓度(x)和还原力(y)进行线性拟合,结果图5所不。由图5可知,随着样品质量浓度的升高,还原力升高,可见样品剂量和还原力效应之间呈现出良好的线性关系,相关系数均＞0.995。半抑制浓度(50 inhibiting concentration,IC50)分析结果表明,还原力从大到小依次是:360 d诺丽酵素=720 d诺丽酵素＞540 d诺丽酵素＞VC(0.5 mg/mL),3个不同发酵时间点诺丽酵素的还原力并无显著差异(P＞0.05),但还原力显著高于0.5 mg/mL VC(P＜0.05)。

图5 诺丽酵素对Fe3+还原力Fig.5 Reducing power for Fe3+of noni Jiaosu

综上所述,不同发酵时间的诺丽酵素对于DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和还原力并未表现出明显的差异(P＞0.05),说明发酵时间延长,其抗氧化性趋于平衡。不同发酵时间诺丽酵素总酚含量已趋于稳定,这也是在宏观上表现出抗氧化性能趋于稳定的可能原因。

2.2 氨基酸与蛋白质营养评价

2.2.1 可溶性蛋白质与氨基酸含量

采用考马斯亮蓝法对不同发酵时间诺丽酵素中可溶性蛋白质含量进行测定结果见图6。由图6可知,三个不同发酵时间的诺丽酵素中可溶性蛋白质含量为3.70～4.00mg/mL,其中发酵720 d诺丽酵素蛋白质含量最高,达4.00 mg/mL。蒋增良等[18]对树莓酵素发酵过程中的蛋白质含量变化研究发现,随着发酵时间的延长,蛋白质含量有显著上升(P＜0.05),在发酵第56天含量比发酵前增加了87.30%。张伟敏等[19]研究发现,诺丽果实中蛋白质质量浓度为8.09g/L,高于本研究所检测到的诺丽酵素中蛋白质含量,可能是发酵工艺中的外加水和糖类等其它辅助物,导致蛋白质浓度相对下降。

图6 3种不同发酵时间诺丽酵素中的蛋白质含量Fig.6 Protein contents of noni Jiaosu with 3 different fermentation time

氨基酸是构成蛋白质的基本物质,对3种不同发酵时间(360 d、540 d和720 d)的诺丽酵素中的17种蛋白质氨基酸以及非蛋白氨基酸GABA的含量进行测定,有利于系统性地评价蛋白质营养价值。3种不同发酵时间的诺丽酵素发酵液氨基酸分析图谱见图7。由图7可知,17种蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸GABA分离效果良好,Ⅰ、Ⅱ两条基线分别为第一通道和第二通道,检测波长分别为570 nm和440 nm,除脯氨酸(Pro)通过第二通道检测,其他氨基酸均通过第一通道检测。

图7 不同发酵时间诺丽酵素发酵液氨基酸图谱Fig.7 Chromatograms of amino acids of noni Jiaosu at different fermentation time

表1 诺丽酵素氨基酸种类和含量分析Table1 Analysis of types and concentration of amino acid for noni Jiaosu

2.2.2 必需氨基酸得分

3种酵素中均检测出9种人体必需氨基酸,但蛋白质营养价值不仅与氨基酸种类有关,也与氨基酸的比例有关。本研究将3种酵素中的必需氨基酸与FAO/WHO模式氨基酸[22-23]做对比,计算氨基酸得分(AAS),结果见表2。

根据模式氨基酸评价方法,AAS值越接近于100%,蛋白质营养价值越高。由表2可知,诺丽酵素中除Met+Cys得分在100%～200%之间,其他氨基酸得分明显高于1 000%,蛋白质营养严重过剩。3种诺丽酵素AAS平均值均＞1000%,其中发酵540d的诺丽酵素AAS值最高,平均值为1271.87%。

表2 诺丽酵素氨基酸得分结果Table2 Results of amino acid score of noni Jiaosu

2.2.3 蛋白质营养评价

氨基酸比值[23]定义为一定量食物中氨基酸的含量相当于模式氨基酸的倍数。氨基酸比值系数(RC)用于判定限制氨基酸和计算限制氨基酸的强化量。如果样品中氨基酸的组成与模式氨基酸相等,则必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)等于1,RC等于1。同理,当RC＜1,表不相应氨基酸相对不足;当RC＞1,则表不相应氨基酸相对过剩。比值系数分(SRC)主要用于蛋白质营养价值的评价。SRC描述了食物中各类必需氨基酸偏离氨基酸模式谱的离散度,其数值越接近100,表明该食品中各种必需氨基酸的含量越均衡[24]。

3种不同发酵时间诺丽酵素的RAA、RC和SRC值见表3。从表3可知,Met+Cys的RC值最小,为限制氨基酸;Leu和Lys的RC值＜1,氨基酸相对不足;此外,其他几种氨基酸相对过剩;3种诺丽酵素SRC值均＞55,发酵过程中蛋白质营养均衡度有轻微下降,这可能是部分蛋白质作为微生物的营养源被消耗掉,可以通过在后期发酵过程中补加蛋白质营养来实现蛋白质相对稳定的含量。

表3 诺丽酵素RAA,RC与SRC值分析结果Table3 Analysis results of RAA,RC and SRC of noni Jiaosu

3 结论

本实验对3种不同发酵时间的诺丽酵素中总酚含量和体外抗氧化活性进行研究,并以FAO/WHO建议的氨基酸评分标准对3种诺丽酵素的氨基酸和蛋白质营养进行评价。

3种酵素对DPPH自由基清除能力由高到低依次是:VC(0.5 mg/mL)＞720 d诺丽酵素＞360 d诺丽酵素＞540d诺丽酵素;对于体外ABTS自由基清除能力由高到低依次是:360 d诺丽酵素＞540 d诺丽酵素＞720 d诺丽酵素＞VC(4 mg/mL);对Fe3+还原力由高到低的顺序依次是:360 d诺丽酵素=720d诺丽酵素＞540d诺丽酵素＞VC(0.5mg/mL)。从抗氧化指标上分析,发酵504 d和720 d的诺丽酵素相比发酵360 d的诺丽酵素并没有呈现出显著的优势。

氨基酸分析结果表明,除Cys外,3种诺丽酵素均检测出16种常见蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸GABA,随着发酵时间的延长,蛋白质含量有轻微下降,GABA含量有所上升。说明适当的延长发酵时间能使GABA富集。

3种诺丽酵素中必需氨基酸含量丰富,9种必需氨基酸AAS值均＞100%,蛋白质营养严重过剩。3种诺丽酵素SRC值均＞55,营养价值较高,但由于Met+Cys的缺乏,直接影响了诺丽酵素的营养均衡度,所以Met+Cys为第一限制性氨基酸。发酵过程中蛋白质营养诺丽酵素营养均衡度有轻微下降,导致蛋白质营养价值降低。说明单纯从蛋白质营养价值来看,发酵时间的累积并没有有效的改善诺丽酵素的营养价值。