基于内转录间隔区序列鉴定浓香型大曲发酵表面霉菌

何宏魁,李静心*,丁 锋,王艳丽,刘国英

(安徽古井贡酒股份有限公司,安徽 亳州 236820)

中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一,具有悠久的历史和深厚的酒文化内涵,深受消费者喜爱[1]。其中浓香型白酒具有“绵柔甘洌、芳香浓郁、香味协调、尾净余长、入口甜、落口绵”的酒体风格,在我国白酒行业中占据主导地位[2]。大曲是白酒生产过程中主要的糖化剂和发酵剂,在酿造过程中起着糖化、生香、发酵、提供微生物的作用,具有“曲为酒之骨”的美称,可见大曲在发酵中的重要地位[3]。大曲中含有丰富的微生物种群,其中霉菌可以产生淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等丰富的酶系,酵母则具有酒精发酵能力及产酯能力,对白酒中酒精及香味物质的产生起着十分重要的作用[4]。

浓香型大曲生产时,培菌期的湿度、温度都非常适宜于酵母菌和霉菌的生长,部分曲块在挂衣阶段表面长满霉菌菌丝,有时菌丝生长过于旺盛,导致大曲曲块通风不畅,不利于后期曲块水分的蒸发及大曲的成熟。对曲块表面霉菌进行鉴定,从而了解其是否属于大曲生产过程中的有利微生物,对大曲的质量控制有重要帮助。目前霉菌的鉴定多通过观察菌丝体和分生孢子头的形态,结合菌落形态和生理生化特性,确定霉菌的生物学分类。而大曲表面的菌丝可能是多种霉菌混合体,难以通过形态学观察、菌落形态和生理生化特性鉴定。

本研究拟采用构建内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)克隆文库的方法,对大曲生产挂衣阶段表面霉菌进行分子生物学鉴定,从而确定表面霉菌的生物学分类,对大曲生产中的质量控制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

挂衣阶段的曲块(取样时间为曲胚进房后的5～7d,此时曲块处于主发酵期):采自安徽古井贡酒股份有限公司。

核酸纯化柱套件、胶回收试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galac topyranoside,X-gal)、T-载体PCR产物克隆试剂盒、酚氯仿异戊醇溶液(25∶24∶1,V/V)、氨苄青霉素:生工生物工程(上海)股份有限公司;Taq酶、E.coli DH5α感受态细胞、LB液体培养基、SOC培养基:大连宝生物工程有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)、盐酸胍、无水乙醇(分析纯)、营养琼脂:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Arktik多功能聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)仪:美国Thermo公司;BioSpectrum 610化学发光成像系统:美国UVP公司;G-26C高速冷冻离心机:德国Sartorius公司;DYY-6C电泳仪:北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

使用注射器针头小心挑取曲块每面中心少量菌丝,置于2mL离心管中混匀,加入1mL 2%CTAB溶液和0.5g玻璃珠,振荡离心后转移上清至新的离心管,加入等体积酚氯仿异戊醇溶液抽提,离心取上清,加入2倍体积的6 mol/L盐酸胍溶液,混匀后加入核酸纯化柱,离心弃滤液,重复步骤直至溶液全部通过核酸纯化柱,体积分数70%的乙醇清洗2遍后加入30～50μL无菌水,离心得到DNA溶液,-20℃保存备用。

1.3.2 样品ITS片段的扩增和纯化

本研究采用通用引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'扩增真菌18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S片段。扩增体系为50μL:DNA模板5μL,10×PCR buffer 5μL,脱氧核糖核苷酸(deoxy-ribonucleotide triphosphate,dNTP)Mixture 5μL,引物ITS1和ITS4各1.5μL,TAKARA Taq酶0.5μL,双蒸水(ddH2O)补齐至50μL。PCR反应条件为95℃预变性5 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,共循环25次;72℃最终延伸10 min。扩增好的PCR产物用1%琼脂糖凝胶、180 V电泳20 min,电泳液为1×TAE。在紫外灯下将PCR扩增的ITS片段切下,胶回收试剂盒纯化后-20℃保存。

1.3.3 连接、转化和蓝白斑筛选

切胶回收产物使用T-载体克隆试剂盒于16℃连接12h。在100μL感受态细胞中加入10μL连接液,置于冰上放置30 min,42℃热应激90 s,加入900μL SOC培养基,37℃、200r/min振荡培养45min。在含氨苄青霉素的营养琼脂平板上加入10μLIPTG(100mmol/L)和100μLX-gal(20mg/mL)并涂布均匀,放置10～30 min后加入菌液涂布均匀,于37℃恒温箱中倒置培养过夜。

1.3.4 单克隆鉴定及测序分析

挑取白色菌落至5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min振荡培养8～12h,采用通用引物M13-47:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'和M13-48:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'进行菌液PCR。PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳,所有扩增大小为500～750 bp左右的克隆即为构建的ITS文库。将文库中的所有克隆用M13F和M13R两对引物进行测序,对测序得到的序列进行拼接、去载体、去嵌合体后,使用UNITE数据库进行比对,从而对大曲表面霉菌组成进行分析。

2 结果与分析

2.1 ITS序列的扩增

大曲表面霉菌ITS序列的PCR扩增结果如图1所不。

图1 大曲表面霉菌ITS序列的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of ITS sequence of mold from Daqu surface

由图1可以看出,PCR产物的片段长度为750 bp左右。

2.2 阳性克隆的检测和测序

经过蓝白斑筛选(见图2),从ITS克隆文库中随机挑选24个白色克隆至5 mL LB培养基中,振荡培养后用M13F/R引物PCR鉴定,结果表明,24个克隆中共有20个阳性克隆,阳性率为83.33%。将20个阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

图2 大曲表面霉菌ITS文库蓝白斑筛选结果Fig.2 Blue-white selection results of ITS library of mold from Daqu surface

2.3 霉菌鉴定结果分析

对测序得到的序列进行拼接、去载体、去嵌合体后,按照97%的相似性划分操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),20个克隆共得到2个OTU,每个OTU选取部分代表性序列,使用UNITE数据库Blast比对代表序列,所得结果见表1。

表1 大曲表面霉菌ITS文库OTU的划分与鉴定Table1 Division and identification of ITS library OTU of mold from Daqu surface

测序结果经比对后发现,19个克隆为米根霉(Rhizopus oryzae),1个克隆为扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)。由于酵母菌一般不会形成菌丝,因此可以推测曲块表面生长的黑色菌丝体为米根霉。

米根霉(Rhizopusoryzae)在生物学分类上属于毛霉科(Mucoraceae),根霉属(Rhizopus),是一种非常重要的酿酒微生物,在许多酒曲中都有发现。其在培养基上菌落呈疏松或稠密的絮状,菌丝最开始呈白色,随着孢子囊的逐渐成熟慢慢变为褐灰色至黑褐色[5]。在制作大曲的过程中,曲块表面可观察到的菌丝体多数就是米根霉,其菌丝与生长在培养基上相似,初为白色,随着大曲的发酵和成熟逐渐变为灰褐色或黑褐色[6]。

目前许多研究表明米根霉可产生较多的胞外酶和胞内酶,如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、单宁酸酶、植酸酶等可用于工业生产的酶[7-11]。此外,米根霉能够分泌较高水平的L-乳酸[12-15]、富马酸[16-17]和乙醇[18-19],其安全性已通过了美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)认证[7]。

3 结论

为了分析浓香型大曲生产时部分曲块表面生长的霉菌的生物学分类,本研究采用构建ITS克隆文库的方法,对大曲表面霉菌进行了分子生物学鉴定,结果表明,曲块表面生长的菌丝体为米根霉(Rhizopusoryzae)。