正交试验优选女士保健酒渗漉工艺

李 妍,梁慧珍,张长霞,苏 静,陈 鹏,贾士儒*

(1.天津科技大学 生物工程学院,天津 300457;2.天士力控股集团研究院健保食品开发中心,天津 300000)

保健酒已有数千年的历史,是中国医药科学的重要组成部分[1]。女士保健酒的主要药材有当归、人参、黄精、玉竹、枸杞子、大枣,该配方具有调经止痛、补血活血、益气安神的功效。其中人参为君药,补气安神[2];当归、黄精、玉竹为臣药,补肾益精[3-7];配伍枸杞子能滋补肝肾之阴[8];大枣在增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、改善心血管系统、造血等方面有着明显药理作用[9],王留等[10]研究了在日粮中添加1 500 mg/kg的大枣多糖能够提高断奶仔猪血液中超氧化物歧化酶的含量和总抗氧化能力,降低丙二醛含量。六味药合用有抑制黑色素生长、抗氧化等功效。当归中含有多种有机酸类化合物,其代表为阿魏酸[11]。阿魏酸效应物在较低浓度下能显著降低酪氨酸酶的单酚酶活力,是一种强效的酪氨酸酶抑制剂[12]。5 mol/L的阿魏酸可有效抑制虾血淋巴褐变,阿魏酸将虾血淋巴中酪氨酸酶酶活抑制至5.97%[13]。人参提取液具有很强的抑菌消炎作用,是高档化妆品的天然添加物,对妇女雀斑、褐斑、蝴蝶斑及老年皮肤色素沉着疗效显著[14]。刘恋等[15-17]研究了枸杞子水提物对酪氨酸酶活性的影响,枸杞子多糖对酪氨酸酶活性抑制能力很强,枸杞子水提物对酪氨酸酶具有明显抑制作用,其半数抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.73 mg/mL。沈放等[18]研究了当归多糖对酪氨酸酶活性的影响,结果表明当归多糖对酪氨酸酶活性有较高的抑制作用,用体积分数为50%的乙醇提取当归后的浓缩浸膏进行酪氨酸酶-多巴氧化实验,当归浸膏(1 g/L)的酪氨酸酶抑制率为35.8%[19],具有良好的美白功效。酪氨酸酶在黑色素细胞代谢过程中起着催化作用,引起黑色素分泌增多,因此抑制该酶的活性就能减少色素的生成[20]。现有的活性成分提取方法包括浸提和渗漉,浸提现在最为常用,简单方便,对设备要求比较低,能耗低,目前广泛应用于工业生产,但得率不高,耗时长,限制保健酒的生产效率;与之相比较,渗漉属于动态浸出方法,具有溶剂利用率高,有效成分浸出完全,可直接收集浸出液等优势[21-22]。

本研究采用正交试验,以阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re及粗多糖含量为代表性指标并进行多指标综合评分,对女士保健酒中当归、人参、枸杞子、黄精、玉竹、大枣药材的渗漉工艺进行优化,为最佳渗漉工艺参数的确立提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 药材

实验所用药材见表1。经检验,所用药材均符合《中国药典》(2015年版一部)的规定。

表1 实验所用药材Table1 Medicinal materials used in the experiment

1.1.2 化学试剂

食用酒精(纯度95.2%):吉林省新天龙实业股份有限公司;磷酸(色谱纯):上海晶都生物技术有限公司;乙腈(色谱纯):美国OMNI公司;盐酸(分析纯):天津市风船化学试剂科技有限公司;酒石酸钾钠(分析纯)、亚铁氰化钾(分析纯):天津威晨化学试剂科贸有限公司;硫酸铜(分析纯)、无水葡萄糖(纯度98.0%)、氢氧化钠(分析纯)、亚甲基蓝(指不剂):天津市化学试剂一厂;人参皂苷Rg1(纯度91.7%)、人参皂苷Re(纯度98.0%)、阿魏酸(纯度99.0%):中国食品药品检定研究院;甲醇(色谱纯):德国默克股份两合有限公司。

1.2 仪器与设备

Venusil MPC C18(2)色谱柱:天津博纳艾杰尔科技有限公司;KQ-250E型超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;安捷伦1260高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪:美国安捷伦公司;Milli-Q超纯水处理系统:北京艾泽信科技有限公司密理博北京代理;欧美国家进口膜(尼龙膜):天津市津腾实验设备有限公司;XS105型十万分之一天平:梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DL-I-15台式封闭电炉:天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 渗漉工艺优化单因素试验

影响渗漉工艺的主要因素有渗漉温度、渗漉流速、渗漉前浸泡时间。在正交试验前,首先进行渗漉温度(4℃、20℃、25℃、30℃、35℃)、渗漉流速(0.2mL/min、0.4mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)、渗漉前浸泡时间(8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)单因素试验,对渗漉工艺的因素与水平进行初步筛选。

1.3.2 渗漉工艺优化正交试验

在单因素试验基础上,以渗漉温度(A)、渗漉流速(B)、渗漉前浸泡时间(C)为影响因素,阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re和粗多糖含量为考察指标,优化渗漉工艺,正交试验因素与水平见表2。

表2 渗漉工艺优化正交试验因素与水平Table2 Factors and levels of orthogonal tests for percolation process optimization

1.3.3 考察指标的确定及评价方法

女士保健酒中的当归、人参、枸杞子、大枣、玉竹和黄精具有较多生物活性成分,其中代表性成分有阿魏酸,人参皂苷Rg1、Re和粗多糖。故在渗漉工艺中以阿魏酸含量、人参皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量为评价指标进行综合评分,以考察提取是否完全。

本课题研究采用多指标试验简易综合评分法,可化多指标为单指标。阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re和粗多糖的含量除以各自的标准差,乘以各自的权重系数。

确定权重系数:考虑到女士保健酒六味药的君臣佐使关系及所含功效成分的特点,选择阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re和粗多糖作为评价指标。根据主成分权重系数大原则,阿魏酸含量(ai)(权重系数为0.30)、人参皂苷Rg1含量(bi)(权重系数为0.15)、人参皂苷Re含量(ci)(权重系数为0.15)和粗多糖含量(di)(权重系数为0.40),进行综合评分(xi)[23],其计算公式如下:

式中:xi为综合评分,分;ai为阿魏酸含量,mg/L;bi为人参皂苷Rg1含量,mg/L;ci为人参皂苷Re含量,mg/L;di为粗多糖含量,mg/L;s1,s2,s3,s4依次为阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re和粗多糖测定含量的标准差。

1.3.4 阿魏酸含量的测定[24]

采用高效液相色谱法测定阿魏酸含量。

色谱条件:Venusil MPC18(2)色谱柱(4.60mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83,V/V);检测波长为316 nm;柱温35℃,流速0.80 mL/min,进样量:10μL。

对照品溶液的制备:精密称取阿魏酸对照品适量,置于棕色量瓶中,加体积分数为70%甲醇制成0.036 mg/mL的阿魏酸标准溶液。供试品溶液的制备:取酒液样品过0.45μm膜滤。

测定方法:精密吸取已配制质量浓度为0.036mg/mL的对照品溶液0.10 mL、0.70 mL、1.40 mL、2.10 mL、2.80 mL、3.50 mL,分别于5 mL容量瓶中,加体积分数为70%甲醇稀释至刻度,摇匀,分别进样10μL,记录色谱图和峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,阿魏酸质量浓度(X)为横坐标,绘制标准曲线,得线性回归方程为Y=63 989X-0.767 6,相关系数R2=0.999 9。另精密吸取供试品溶液10μL注入HPLC色谱仪,记录峰面积;分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定,按照标准曲线回归方程计算样品中阿魏酸含量。

1.3.5 人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量的测定

采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量。

色谱条件:Venusil MPC18(2)色谱柱(4.60mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-0.05%磷酸溶液(V/V);检测波长为316 nm;柱温35℃,进样量:10μL。梯度洗脱条件见表3。

表3 高效液相色谱流动相梯度洗脱条件Table3 Gradient elution conditions for mobile phase of HPLC

对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品和人参皂苷Re对照品,加色谱级甲醇制成0.20mg/mL的溶液。供试品溶液的制备:取酒液样品过0.45μm膜滤。

测定方法:取已配制质量浓度为0.11mg/mL、0.20mg/mL、0.30 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Rg1对照品溶液,分别进样10μL,记录色谱图和峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,人参皂苷Rg1质量浓度(X)为横坐标,绘制人参皂苷Rg1标准曲线,得线性回归方程为Y=4 371.3X+10.224,R2=0.999 0。另精密吸取供试品溶液10μL注入HPLC色谱仪,记录峰面积分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定,按照标准曲线回归方程计算样品中人参皂苷Rg1含量。

取已配制质量浓度为0.11 mg/mL、0.20 mg/mL、0.30 mg/mL、1.00 mg/mL、0.45 mg/mL、0.55 mg/mL的Re对照品溶液,分别进样10μL,记录色谱图和峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标,人参皂苷Re质量浓度(X)为横坐标,绘制人参皂苷Re标准曲线,得线性回归方程为Y=3 733.3X+5.708 3,R2=0.999 0。另精密吸取供试品溶液10μL注入HPLC色谱仪,记录峰面积分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪测定,按照标准曲线回归方程计算样品中人参皂苷Re含量。

1.3.6 粗多糖含量的测定

样品粗多糖沉淀:准确吸取保健酒酒液5.00 mL,置于50 mL离心管中,加入20.00 mL无水乙醇,混匀,于4℃冰箱中静置4 h以上,以9 000 r/min离心10 min,弃去上清液,残渣用体积分数为80%乙醇溶液洗涤,离心后弃去上清液,反复操作3次。残渣用水溶解并定容至100 mL。

葡萄糖标准曲线绘制:准确吸取葡萄糖标准溶液(2.5g/L)0.10mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL置于25mL比色管中,补水至2.00mL,加入5%苯酚溶液1.00mL,在漩涡混合器上混匀,加入硫酸10.00mL,在漩涡混合器上小心混匀,置沸水浴中2.00 min,冷却至室温,在485 nm波长处以实际空白为参比,测定吸光度值。以葡萄糖质量浓度(X)为横坐标,吸光度值(Y)为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线,得线性回归方程为Y=6.328 1X+0.007 5,R2=0.999 5。

样品测定:准确吸取100μL置于25 mL比色管中,补加水至2.00 mL,然后按照葡萄糖标准曲线绘制中的测定方法进行吸光度值的测定,按照葡萄糖标准曲线回归方程计算样品中粗多糖含量。

2 结果与分析

2.1 渗漉工艺优化单因素试验

2.1.1 渗漉温度对渗漉工艺条件的影响

表4 温度对渗漉工艺条件的影响Table4 Effect of temperature on percolation process conditions

由表4可知,渗漉流速在4～35℃范围时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量随温度增大而增加;温度为35℃时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量达到最大,分别为7.94mg/L、32.75mg/L、18.34mg/L、23658.46mg/L,药材中的有效成分在较高温度环境下更容易渗出。因此,选择35℃为最佳渗漉温度。

2.1.2 渗漉流速对渗漉工艺条件的影响

由表5可知,渗漉流速在0.20～0.80 mL/min范围时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量随渗漉流速增大而增加;渗漉流速为0.80 mL/min时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量达到最大,分别为6.01 mg/L、31.01 mg/L、17.95 mg/L、22 990.71 mg/L;渗漉流速＞0.80 mL/min之后,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,原因是药材中的有效成分来不及渗出,渗漉液白酒已经滴完。因此,选择0.80 mL/min为最佳渗漉流速。

表5 渗漉流速对渗漉工艺条件的影响Table5 Effect of flow velocity on percolation process conditions

2.1.3 渗漉前浸泡时间对渗漉工艺条件的影响

表6 渗漉前浸泡时间对渗漉工艺条件的影响Table6 Effect of soak time before percolation on percolation process conditions

由表6可知,渗漉前浸泡时间在8～24 h范围时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量随渗漉前浸泡时间增大而增加;渗漉前浸泡时间为24 h时,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量达到最大,分别为6.01 mg/L、31.01mg/L、17.95mg/L、22 990.71mg/L;渗漉前浸泡时间＞24 h之后,阿魏酸、人参皂甙Rg1和Re、粗多糖的含量均有所下降,药材中的有效成分渗出到一定程度达到极限,不能继续渗出,随着渗漉前浸泡时间延长,有效成分反而减少。因此,选择24 h为最佳渗漉前浸泡时间。

2.2 渗漉工艺优化正交设计试验结果分析

9组渗漉完成后,经高效液相色谱及紫外分光光度计检测阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和粗多糖含量如表7所不。

表7 样品中各指标的测定结果(n=2)Table7 Determination results of each index in the samples(n=2)

按表7的试验结果计算,阿魏酸的标准差s1为2.41,Rg1的标准差s2为1.13,Re的标准差s3为1.52,粗多糖的标准差s4为3559.75。通过简易综合评分法,将阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和粗多糖含量多指标为单指标,计算出结果。

表8 渗漉工艺优化正交试验结果与分析Table8 Results and analysis of orthogonal tests for percolation process optimization

由表8可知,3个因素对阿魏酸含量、人参皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量均有影响,通过极差值得大小得出影响因素顺序依次为A＞B＞C,说明影响女士保健酒渗漉工艺综合评分中渗漉温度和渗漉流速是主要因素,而渗漉前浸泡时间次之;由极差分析得出渗漉工艺最佳组合为A3B1C2,即渗漉温度为36℃,渗漉流速为0.4 mL/min,渗漉前浸泡时间为24 h。

表9 正交试验结果方差分析Table9 Variance analysis of orthogonal tests results

由表9可知,渗漉温度和渗漉流速对结果影响显著(P＜0.05),渗漉前浸泡时间对结果影响不显著(P＞0.05)。

2.3 验证试验

为了进一步验证正交试验合理性按优选出的最佳工艺条件A3B1C2,重复进行3批样品试验。结果见表10。

由表10可知,3批样品所提得阿魏酸含量、人参皂苷Rg1、Re含量和粗多糖含量都接近正交试验中的36℃渗漉的最大值,表明此最佳工艺合理,可作为批量生产的工艺参数。

表10 验证试验结果Table10 Results of validation tests

3 结论

运用正交设计方法进行试验,以求得最优的渗漉工艺。在所选因素水平范围内,按综合加权评分法判定,影响女士保健酒渗漉工艺的因素依次为A＞B＞C,即渗漉温度＞渗漉流速＞渗漉前浸泡时间,且渗漉温度和渗漉流速为提取过程中的显著影响因素(P＜0.05)。又因为常温渗漉节约能耗和生产成本。故最终选择A3B1C2为最佳渗漉条件,即36℃渗漉、流速选择0.4 mL/min、渗漉前浸泡时间选择24 h。在此优化渗漉工艺条件下,综合评分为9.66分,阿魏酸、人参皂苷Rg1、Re及粗多糖含量的分别为7.03 mg/L、31.86 mg/L、17.69 mg/L、22 647.20 mg/L。

本试验以阿魏酸、人参皂苷Rg1和Re和粗多糖含量为评价指标,筛选渗漉工艺,有利于兼顾各指标的协同效应,符合中药复方多成分多靶点起效的特点,较单一指标筛选更加科学、合理,而且操作方法简便,结果容易统计,且优化后的渗漉工艺结果稳定可靠,可为进一步开发女士保健酒提供重要依据。