4-NQQ诱导小鼠舌癌形成过程中的血清差异蛋白筛选

李 邦，王 飞，张亚军，刘来奎，孙应明

全球每年约35万人被诊断为口腔癌，其中舌癌约占40%左右，为最常见的口腔癌[1]。近年来舌癌的发病率有上升趋势，且其早期诊断困难并伴有高转移率，所以尽管最近提出了很多新的治疗方法，但患者的5年生存率一直未见明显的提高，仅50%左右[2]。因此寻找舌癌的早期诊断标志物以及探索舌癌形成的机制变得越来越重要。目前舌癌的发病机制尚不明了，研究[3]表明长期的小剂量接触致癌物导致基因突变可引起组织发生恶性转化而发生癌变。其中蛋白组学技术能全面地检测生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式，并且在肿瘤的早期筛选、探索肿瘤治疗的新靶点中发挥重要的作用。在致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQQ)诱导舌癌模型中，整个实验历时较长，经历小鼠生长发育的整个时期，与人类舌黏膜癌变过程相类似，能很好地模拟人舌癌形成的过程[3]。该研究采用4-NQQ诱导小鼠舌黏膜癌变，然后取3个特定时间点小鼠血清行蛋白组学分析，筛选舌癌形成过程中其血清的差异表达蛋白，以期筛选出舌癌早期诊断的肿瘤标志物。

1 材料与方法

1.1实验动物及舌癌模型诱导100只C57BL/6小鼠(雌雄随机)，SPF级，鼠龄6～8周，购自南京医科大学医学实验动物中心。将100只小鼠随机分为10组，每组10只。在10组小鼠中，随机挑选5组为实验组，5组为对照组。实验组饮用水中加入4-NQQ，浓度为0.004%，对照组小鼠正常饲养。分别在8、12、16、20、24周时处死小鼠，取舌头。右心室取小鼠静脉血，1 000 r/min离心20 min，取上清血清，-80 ℃保存，避免反复冻融。

1.2小鼠舌黏膜组织病理学观察在特定时间点处死小鼠后取舌头，浸泡在4%多聚甲醛中，脱水、石蜡包埋、切片、HE染色。舌癌的组织学分析：在双盲实验中，两名病理医师为小鼠舌黏膜病变程度打分，使用如下打分系统：0=无改变；1=轻度异型增生，上皮的紊乱及细胞异型局限在上皮下1/3；2=中度异型增生，上皮紊乱及细胞异型局限在上皮的中1/3；3=重度异型增生，上皮的紊乱及细胞异型超过上皮的2/3；4=浸润癌，肿瘤细胞突破基底膜沿舌肌向下浸润。

1.3iBT定量蛋白组学分析在小鼠舌黏膜出现典型病变时取小鼠静脉血清即在8周(舌黏膜开始出现异常时)、16周(轻度异型增生)、24周(开始出现浸润癌)时。随机取其中5只小鼠血清混合后(满足iBT实验所需，剩余血清进行其他实验)行iBT定量蛋白组学分析(深圳华大基因)，血清蛋白按如下步骤进行分析：蛋白提取、蛋白酶解、肽段标记、肽段分离、质谱检测。原始数据获得后进行如下分析：选择蛋白数据库、Mascot(版本为Mascot2.3.02)搜索使用、蛋白iBT定量、差异蛋白通路富集分析。当蛋白差异满足差异比值>1.5及P<0.05时，认为该蛋白为差异蛋白。

1.4统计学处理差异蛋白统计学分析使用IQuant软件(华大基因)，IQuant显示蛋白差异有统计学意义是根据Benjamini-Hochberg计算法中的多重假设分析。

2 结果

2.1舌癌模型诱导为了探索舌癌形成过程中，血清蛋白表达的变化，为舌癌的治疗及早期诊断提供依据。在小鼠的饮用水中加入4-NQQ诱导小鼠舌黏膜癌变。在成瘤实验过程中，小鼠在16周时开始出现活动性下降，20周时小鼠成堆蜷缩在笼子一角，厌食，活动减少，且1只实验组小鼠死亡(死亡原因不明)，24周时小鼠毛发稀疏无光泽，颏部可见食物碎屑结痂且潮湿，部分小鼠呈恶病质状濒死状，部分小鼠体重仅16 g左右。小鼠舌外观8周时开始出现邹缩、粗糙，20周时开始出现疣状物凸起及白斑，24周时小鼠出现疣状物凸起的比例增加，且单个舌头上疣状物的数量増多(图1 A)。病理学结果如下：其中8周时10只小鼠舌黏膜均无明显异型增生，但部分小鼠舌黏膜出现增生及过角化；12周时70%出现轻度异型增生；16周时100%出现轻度异型增生；20周时33.33%出现轻度异型增生，44.44%出现中度异型增生，22.22%出现重度异型增生。24周时10%小鼠出现浸润癌，10%重度异型增生，60%中度异型增生，20%轻度异型增生(图1 B、表1)。

2.2iBT定量蛋白组学分析两个对比组即8周/16周和16周/24周共发现差异蛋白194种，其中8周/16周共检测到89种差异蛋白，其中62种上调蛋白，27种下调蛋白，16周/24周共检测到105种差异蛋白，其中43种上调蛋白，62种下调蛋白(图2 A)。其中差异蛋白通路富集分析提示：RAS信号通路、NF-κB通路、PI3K信号通路、Pathway in cancer信号通路、Proteoglycans in cancer信号通路、JAK-STAT信号通路、microRNA in cancer信号通路在舌癌形成过程中持续异常。在8周和16周对比组中发现癌相关蛋白：纤连蛋白(Fibronectin，FN)和原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPMI)低表达。在16周和24周的对比组中发现癌相关蛋白Four and a half LIM domains protein 1(FHL1)、FN、热休克蛋白(heat shock protein 84b，HSP 84b)、serine/threonine-protein (PP2A)、蛋白聚糖 4(Proteoglycan 4，ECM)、14-3-3 protein gamma subtype and MCG126220 and Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(14-3-3)低表达(图2B、表2)。

图1 4-NQQ诱导小鼠舌黏膜癌变

异型增生登记8周实验组对照组12周实验组对照组16周实验组对照组20周实验组对照组24周实验组对照组01010310010010010100701003020200000040603000000201040000000010合计1010101010109101010

表2 蛋白组学结果：3个时间点两个对比组的差异蛋白

3 讨论

舌癌作为最严重的口腔疾病，但是常常被人认为是其他口腔疾病如口腔溃疡、舌肿块等而被忽视，由于其早期转移率高，大多数在确诊时常常已发生了颈淋巴结转移，给治疗带来很大的困难。并且由于其缺乏早期诊断标志物，且常常被忽视，因而早期发现并诊断舌癌变得异常困难。

蛋白组学技术具有高敏感性和特异性，能广泛地分析鉴定蛋白质，在肿瘤的特异性标志物的筛选及肿瘤形成机制的研究中发挥着越来越重要的作用。血液是临床体检、疾病筛查等工作中常见的样本，其中血清中含有大量的免疫球蛋白和异质组织蛋白，在使用血清作为临床筛选肿瘤的工作中已取得大量进展，在早癌的筛查中扮演越来越重要的作用。

图2 iBT定量蛋白组学结果

A：两个对比组差异蛋白总览；B：肿瘤相关的差异蛋白各时间点变化折线图

因此课题组使用4-NQQ诱导舌癌模型，在特定的时间点取小鼠血清行蛋白组学分析，希望能筛选出有利于舌癌早期诊断的标志性蛋白质。在小鼠舌癌模型诱导方面，整个实验耗时6个月，模型诱导实验结束时小鼠开始出现浸润性舌癌，但浸润癌出现的比例不高，主要是由于小鼠状态不佳，部分恶病质体重仅16 g左右，呈现濒死状态，因而不得已结束小鼠舌癌诱导实验。诱导实验中使用小剂量致癌物长期刺激小鼠舌黏膜，且经历了小鼠生长发育的整个时期(性成熟期至中老年期)，小鼠的舌黏膜病理改变从轻度异型增生到中度异型增生，然后为重度异型增生，最后发展为浸润癌，该过程与人类舌癌的形成过程相类似，能很好地模拟人舌癌的形成过程与诱因[4]。

蛋白组学分析一共发现差异蛋白194种，其中8周/16周共检测到89种差异蛋白，其中62种上调蛋白，27种下调蛋白，16周/24周共检测到105种差异蛋白，其中43种上调蛋白，62种下调蛋白。其中癌相关蛋白FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等在舌癌形成的过程中有明显差异，未有文献明确报道其能作为舌癌的早期诊断标志物。但有多篇文献[5-8]报道指出它们在肿瘤形成过程中表达紊乱。例如FHL1为肿瘤形成过程中的抑制剂，在肿瘤的形成和进展中发挥重要的作用，蛋白组学的结果提示其在舌癌形成的过程中对比8周持续低表达[5]。基质及细胞中的FN能预测舌癌的进展及转归，当其在肿瘤基质中低表达时舌癌的预后较好，结果提示其在小鼠舌癌形成的过程中低表达[6]。HSP27在舌癌的原发灶中的表达量与肿瘤的低分化关系密切，且其高表达提示患者有个良好的预后，蛋白组学的结果提示HSP 84b在舌癌形成中低表达[7]。PP2A被报道其有可能作为肿瘤的抑制器，蛋白组学的结果提示其在舌癌中高表达，特别是在肿瘤形成的最后阶段即16至24周时[8]。通路分析结果提示癌相关通路如：NF-κB通路、PI3K信号通路、JAK-STAT信号通路等信号通路在舌癌的免疫治疗被广泛应用[9-10]。由于蛋白质学仅仅是初步筛选未能验证，因此课题组下一步计划在人舌癌及正常组织标本中验证蛋白组学中检测的蛋白质如FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等，且对蛋白组学中检测到的可能的异常通路进行验证，进一步揭示舌癌形成的机制，为舌癌的早期诊断提供新的标志物。