脲酶菌的筛选及其对垃圾焚烧飞灰的固化

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(浙江理工大学，a.生命科学学院；b.土木工程与建筑学院，杭州 310018)

0 引 言

垃圾焚烧是当前城市垃圾处置的重要方式。近年来，我国经济发达地区兴建生活垃圾焚烧厂的量逐年递增，2015年底全国生活垃圾焚烧厂多达267座，日焚烧垃圾21.90万吨以上，且年焚烧垃圾量以10%的速度增长[1]。灰渣是生活垃圾焚烧的必然产物，其中包括焚烧炉中产生的底灰和烟气净化系统中收集得到的飞灰，底灰的比重约为20.00%～30.00%，飞灰比重约为3.00%～5.00%[2]。大量研究结果表明，飞灰中易富集Zn、Pb、Hg、Cu、Cr、Cd和Ni等重金属，飞灰内Zn、Pb、Cu、Cr、Cd和Ni含量一般占飞灰干重的0.41%～1.93%、0.14%～0.57%、0.04%～0.11%、0.02%～0.04%、0.01%～0.04%和0.01%～0.02%[3-6]。

本文目的是研究脲酶菌对焚烧飞灰内重金属的固化效果。从丹参根际土壤中筛选获得两株脲酶菌UR-F51和UR-121，对固化飞灰的无侧限抗压强度和颗粒级配进行测定，从而评估脲酶菌UR-F51和UR-121对飞灰的固化能力；对固化后飞灰的重金属浸出浓度进行了测试，从而评估微生物诱导碳酸盐沉积处理后飞灰内重金属的稳定能力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

KH2PO42.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，Na2Ac 2.00 g/L，尿素20.00 g/L，琼脂20.00 g/L，酚红(终浓度为0.01 g/L)。

富集培养基：酵母提取物20.00 g/L，(NH4)2SO410.00 g/L。

筛选培养基：葡萄糖20.00 g/L，蛋白胨2.00 g/L，牛肉膏10.00 g/L，酵母膏3.00 g/L，所用试剂纯度皆为分析纯。城市垃圾焚烧飞灰来源于杭州市萧山区锦江绿色有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脲酶菌的筛选与鉴定

脲酶菌的筛选：称取土壤5.00 g，按10%的接种量与无菌水混合，制成悬浮液。对悬浮液进行倍比稀释后，分别吸取100 μL的1×10-5、1×10-6倍和1×10-7倍稀释液，均匀涂布于固体筛选培养基上，每个梯度3个重复，30 ℃恒温培养，定期观察。然后，挑取使固体筛选培养基颜色变红的不同菌株，在固体筛选培养基上划线纯化培养，30 ℃恒温培养，每隔24 h观察。以尿素为底物，进行脲酶活性测定，具体方法见文献[13]。挑选脲酶活性较高的菌株进行飞灰固化实验。

脲酶菌分子鉴定：对筛选获得的高效脲酶菌进行16S rDNA分子鉴定。采用通用引物27 F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492 R(GGTTACCTTGTTACGACTT)对脲酶菌DNA进行PCR扩增，PCR反应体系和循环参数见文献[14]。PCR扩增产物进行纯化后，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。测序结果与Ezbiocloud库进行Blast比对，利用MEGA 5.0建立系统发育树，从而分析脲酶菌的进化地位。

1.2.2 脲酶菌固化飞灰

1.2.2.1 脲酶菌固化飞灰过程

将垃圾焚烧飞灰于105 ℃烘箱内干燥24 h；脲酶菌UR-F51和UR-121在30 ℃、220 r/min摇床内扩大培养48 h。将垃圾焚烧飞灰与尿素和菌液按1.00 kg：0.027 kg：300.00 mL的比例进行充分混合，称取上述混合物120.00 g，分三次均匀填充于内径36 mm、高80 mm的模具内，后置于温度为20 ℃、湿度为95%的养护箱内养护，24 h后开模，并继续在养护箱内养护6 d。以水处理后的飞灰样品为对照组，每组实验重复3次。

1.2.2.2 固化飞灰的检测

无侧限抗压强度：利用万能伺服试验机(CMT4000)对养护7 d后的模型进行无侧限抗压试验。试验机压力计量程为30 kN，精度为1 N，加载速率为2 mm/min。

固化颗粒级配：取无侧限抗压实验后飞灰样品，在105 ℃的烘箱内烘干24 h，用橡胶槌研碎，按《土工试验规程》(SL237—1999)，采用筛分法和甲种密度计法联合测定颗粒级配，并绘制曲线，颗粒级配的数据处理和分析方法见文献[15]。

重金属的固化率：取无侧限抗压实验后样品，在105 ℃的烘箱内烘干24 h，用橡胶槌研碎，按《固体废物浸出毒性浸出方法-水平振荡法》(HJ 557—2009)，对脲酶菌固化后飞灰进行重金属毒性浸出，并利用ICP-MS技术对脲酶菌固化后飞灰重金属浸出浓度进行测定，计算固化飞灰的重金属固化率。

1.3 统计分析

利用SPSS 20.0软件对实验数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 脲酶菌筛选与鉴定

2.1.1 脲酶活性测定

从土壤内筛选获得2株生长较快的脲酶菌，分别命名为UR-F51和UR-121。对2株脲酶菌进行脲酶活性定量检测，结果见表1。由表1可知，菌株UR-F51和UR-121的脲酶活性分别为14.91 mmol/L和10.19 mmol/L，且菌株UR-F51脲酶活性是UR-121的1.5倍。

表1 脲酶菌UR-F51和UR-121脲酶活性

2.1.2 脲酶菌16S rDNA分子鉴定

对筛选获得的高效脲酶菌进行16S rDNA分子鉴定，并将脲酶菌测序结果与Ezbiocloud库进行比对，脲酶菌UR-121和UR-F51的分子鉴定与Ezbiocloud数据库比对结果，如表2。表2显示：菌株UR-F51与Bacillusaryabhattai、UR-121与Pseudomonastaiwanensis相似度均为99%以上。利用软件MEGA 5.0，建立脲酶菌UR-121和UR-F51的系统发育树，如图1。图1中可见，菌株UR-F51与Bacillusaryabhattai、菌株UR-121与Pseudomonastaiwanensis各自聚为一簇，因此菌株UR-F51为Bacillusaryabhattai，菌株UR-121为Pseudomonastaiwanensis。

表2 脲酶菌UR-121和UR-F51的分子鉴定与Ezbiocloud数据库比对结果

图1 基于16S rDNA序列构建脲酶菌UR-F51和UR-121的系统发育树

2.2 脲酶菌固化飞灰

利用脲酶菌UR-F51和UR-121分别固化垃圾焚烧飞灰，继而测定脲酶菌固化后飞灰的各项指标，即无侧限抗压强度、飞灰颗粒级配、飞灰颗粒SEM检测和重金属固化率。

2.2.1 无侧限抗压强度

脲酶菌固化后飞灰样品在养护箱内养护7 d，然后测定其无侧限抗压强度。脲酶菌UR-F51和UR-121的无侧限抗压强度测定结果如图2所示。由图2可知，脲酶活性与抗压强度呈正相关，脲酶活性较高的UR-F51，其无侧限抗压强度相对其他处理组偏高；UR-F51和UR-121处理组的抗压强度分别为0.42 MPa和0.36 MPa，与对照组相比，分别提高48.46%和27.39%。以上结果表明，脲酶菌固化后飞灰的无侧限抗压强度明显得到提高，且与脲酶活性呈一定的正相关。

图2 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飞灰抗压强度

2.2.2 固化飞灰颗粒级配

采用筛分法和甲种密度计法联合测定固化后飞灰的颗粒级配，并绘制颗粒级配曲线，脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飞灰颗分级配曲线，如图3。结果显示：脲酶菌固化飞灰的颗粒直径在0.00～1.00 mm之间；粒径小于0.01 mm时，处理组间无明显差异，且所有固化后的飞灰所占的百分含量均约为10%；粒径在0.03～0.90 mm之间时，处理组间差异显著，与对照相比，菌株UR-F51和UR-121处理组所占百分含量显著增偏高，且处理组UR-F51所占百分含量显著高于UR-121。以上结果表明：脲酶菌固化后飞灰的颗粒粒径显著变大，且处理组UR-F51的颗分粒径最大，与脲酶菌UR-F51和UR-121固化飞灰后的扫描电镜(图4)结果一致。

图3 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飞灰颗分级配曲线

图4 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后飞灰SEM图

2.3.3 固化飞灰的重金属固化率

脲酶菌UR-121和UR-F51固化飞灰后的重金属浸出浓度结果如表3所示。由表3可知，Cu和Cr的浸出浓度显著高于Ni、Cd、Hg和Pb。菌株UR-F51和UR-121处理组的Cr、Ni、Cu、Cd和Pb浸出浓度显著低于对照，表明2株脲酶菌显著促进飞灰中重金属的固化作用。菌株UR-F51和UR-121处理组固化后飞灰内Cu的浸出浓度分别为0.58 μg/L和132.70 μg/L，固化率分别为99.73%和37.17%；Ni浸出浓度分别为0.09 μg/L和0.55 μg/L，固化率分别为90.43%和41.49%；Cr浸出浓度分别为2.63 μg/L和3.55 μg/L，固化率分别为37.23%和15.27%。以上结果证实菌株UR-F51对飞灰重金属的固化效果最佳。

3 讨 论

本文从土壤中分离出2株脲酶菌BacillusaryabhattaiUR-F51和PseudomonastaiwanensisUR-121，进一步分析发现2株脲酶菌均能增强飞灰的固化作用，其中菌株BacillusaryabhattaiUR-F51对飞灰及其重金属的固化效果最好，在飞灰处理中具有一定的应用潜力。影响飞灰及其重金属的因素有很多，如脲酶菌脲酶活性、环境pH值、脲酶菌代谢产物和飞灰颗粒大小等[8]。

表3 脲酶菌UR-121和UR-F51固化飞灰后的重金属浸出浓度

注：利用spss软件对实验数据进行显著性分析，表内凡有一个相同标记字母的即为差异不显著,凡具不同标记字母的即为差异显著。

4 结 论

飞灰富含重金属等有毒有害物质，对人类的健康造成极大的威胁。许多研究表明，脲酶菌的应用可以缓解城市生活垃圾焚烧飞灰污染。本文通过筛选脲酶菌，并探索脲酶菌生物固化焚烧飞灰的效果，结论如下：

a) 本文从土壤内分离获得2株高效脲酶菌BacillusaryabhattaiUR-F51和PseudomonastaiwanensisUR-121。

b) 2株脲酶菌均能增强飞灰的固化作用，其中菌株BacillusaryabhattaiUR-F51对飞灰及其重金属的固化效果最好，在飞灰处理中具有一定的应用潜力。