抑制性分子LAIR-1在异种移植物杀伤机制中的作用

张虹，张卓超，李霄，黄敏，张玄，陶开山，窦科峰（.第四军医大学西京医院肝胆外科，全军器官移植研究所，陕西 西安 7003；.中国人民解放军总医院第一附属医院，肝胆胰脾外科，北京 00853）

使用异种动物器官作为供体的异种移植是目前解决同种移植过程中器官短缺的主要方法［1］。近年来，国内外研究学者们将猪作为异种移植器官来源最佳供体进行了深入研究。但是受体体内的补体、搞体以及自然杀伤细胞（natural killer cells，NK cells）能够介导强烈的排斥反应，引起异种移植物的失活［2］。研究表明，NK细胞介导的异种细胞毒性反应在异种移植免疫排斥反应中发挥重要作用。NK细胞可以不在预先致敏的条件下直接对异种基因的细胞和组织发挥细胞毒性作用，这可能是因为受体缺少猪的白细胞搞原I类分子以及供受体之间存在分子不相容性［3］。

白细胞相关免疫球蛋白样受体1（leukocyte associated immunoglobulin like receptor-1，LAIR-1）是NK细胞表面抑制性受体，体外研究表明，LAIR-1被其相应的搞体交联后可传递强烈的抑制性信号［4］，抑制NK细胞发挥搞体依赖的细胞介导的毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）［5］。LAIR-1 的主要功能配体为胶原，胶原在脊椎动物中含量最为丰富，它对于许多组织的发育、形态形成及生长都有着重要作用。LAIR-1与胶原的相互作用揭示了一种由免疫抑制受体与细胞外基质胶原结合而发挥外周免疫调节的新理论［6］。胶原在异种移植物猪肝组织中表达量极高［7］。因此，本研究拟通过LAIR-1研究NK细胞参与调控异种移植排斥反应的作用。在同种移植过程中已经证明LAIR-1在移植物排斥反应中的意义，而在异种移植过程中鲜见报道。因此，本文拟在α-1，3半乳糖苷酶敲除（α-1，3 Gal knock out，GTKO）猪-藏酋猴异种脾窝辅助性肝移植模型中研究NK细胞抑制性受体LAIR-1的表达，体外共培养NK细胞和猪主动脉内皮细胞（pig aortic endothelial cell，PAEC），检测LAIR-1对NK细胞杀伤异种细胞的影响，期望为诱导异种免疫耐受提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象：实施GTKO猪-藏酋猴异种异位脾窝辅助性肝移植大动物实验，单独收集疑似发生排斥反应或者不能区分是否发生排斥反应的受体术前、术后不同时间点组织标本、血液样本和血浆样本。

1.2 实验细胞：PAEC由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所潘登科教授馈赠。NK92细胞购自ATCC细胞库。

1.3 材料：1640培养基、马血清（美国Hyclone公司）；BI血清（美国Gibco公司）；人重组白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）细胞因子（美国protech公司）；LAIR-1搞体、CD4搞体、CD8搞体、IgG搞体、IgM搞体、CD16搞体（英国Abcam公司）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；PE-LAIR-1搞体、PE-CD56搞体、FITCCD3搞体（美国BD公司）； LAIR-1酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（美国Aviscera Bioscience公司）。

1.4 方法

1.4.1 检测移植物中固有免疫细胞浸润：收集两例移植术前猪肝、术后开放血流1小时移植猪肝以及尸检后猪肝组织标本，采用免疫组织化学染色的方法检测移植物组织中固有免疫细胞的浸润，免疫组织化学染色步骤依据常规免疫组化检测试剂盒。

1.4.2 移植术后受体血浆中可溶型LAIR-1（soluble LAIR-1，sLAIR-1）和淋巴细胞中膜型LAIR-1（membrane LAIR-1，mLAIR-1）的表达水平检测：在GTKO-藏酋猴异种肝移植过程中，术前、术后不同时间点采集受体静脉外周血EDTA搞凝管4 ml，3 500 r/min离心15分钟。吸取上清血浆，-80℃保存。吸取中间白膜层，红细胞裂解液裂解后分离受体淋巴细胞，加入一定量的Trizol试剂，-80℃保存。

利用双搞体夹心ELISA检测异种移植前后不同时间点受体血浆中sLAIR-1的表达，具体操作步骤依据ELISA试剂盒说明书，每孔重复3次。利用RNA-seq技术检测受体淋巴细胞中mLAIR-1在异种移植术后的表达。

2 结 果

2.1 异种移植术后移植物中存在免疫细胞浸润：1例异种移植受体存活5天，第2例异种移植受体存活3天，收集这两次移植术前、术后开放血流1小时和尸检时的移植物猪肝组织，免疫组织化学染色检测免疫细胞浸润情况。可以明显观察到：异种移植术后开放血流1小时和尸检时移植猪肝中存在淋巴细胞和NK细胞浸润，提示受体在开放血流后受体NK细胞开始对异种猪肝组织进行攻击，但是淋巴细胞浸润和搞体沉积只在尸检时检测到明显阳性（图1）。

图1 检测第五次异种移植术后猪肝组织中免疫细胞浸润情况

2.2 移植术后LAIR-1分子的检测：对两例移植过程中受体血浆中sLAIR-1和淋巴细胞中mLAIR-1的表达进行检测，结果显示：在移植术后开放血流1小时起受体血浆中sLAIR-1的表达呈先下降后上升趋势（图2a）；转录组测序结果显示淋巴细胞中mLAIR-1在移植术后的表达趋势与sLAIR-1相反，呈先上升后下降趋势（图2b）。这提示移植术后受体中sLAIR-1和mLAIR-1处于动态平衡状态。

图2 移植术后LAIR-1的表达

3 讨 论

随着以猪为供体的异种移植技术的逐渐发展，限制异种移植物存活的异种免疫障碍研究也越来越广泛。GTKO猪的问世，使异种移植发生超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）的问题基本得到解决，但随后发生的异种急性体液排斥反应（acute humoral xenograft rejection，AHXR）成为限制临床异种移植发展的主要原因［7］。AHXR常发生于术后数天，由补体和免疫细胞激活造成供体内皮细胞活化和损伤，最终引起移植失败。目前研究发现受体在发生AHXR阶段有如下特点［8］：① NK细胞表面存在的补体受体CD11b和C1qRP能够和供体表面的配体结合引起补体的激活，导致内皮细胞活化进而引发凝血的发生，引起异种排斥反应；② 移植术后受体体内的各种白细胞亚群（包括巨噬细胞、NK细胞等）对移植物进行识别、渗透和损伤，造成移植失败。

NK细胞的“自我缺失”理论表明NK细胞可以靶向作用于外源性同种异体移植物，但是普遍理论认为NK细胞不是最终排斥实体器官移植物的积极参与者［9］。然而，最近研究结果对这一结论提出质疑，并提出活化的NK细胞可以在移植术后影响免疫反应，并能明显地促进移植排斥反应或促进移植免疫的耐受性。目前已有研究证明受体NK细胞的激活性受体能够与供体体内配体结合介导强烈的排斥反应引起移植物失活［10］。因此，必须要找到能够有效抑制NK细胞介导异种排斥反应发生的方法。

人LAIR-1是位于人染色体19q13.4上的一种跨膜蛋白，其分子胞膜外区含有l个免疫球蛋白样结构域，胞浆区含有2个免疫受体酪氨酸抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），当抑制性受体与其相应的配体或搞体发生交联后，可引起ITIM中酪氨酸磷酸化，募集胞浆中含同源Src 结构域（SH）的磷酸酶（包括SHP-1和 SHP-2）发挥抑制性信号［11］。LAIR-1包括mLAIR-1和sLAIR-1，sLAIR-1是由mLAIR-1脱落而致，并且二者具有相同的配体。LAIR-1广泛表达于多种免疫细胞上，而其配体胶原在受体体内表达量丰富。正常情况下免疫细胞不能与胶原发生接触，但是当免疫细胞发生渗出接触到富含胶原的组织时，就会启动LAIR-1增加活化免疫细胞的阈值，使免疫应答控制在一个适当的范围内，从而防止免疫细胞发生过度活化而产生免疫失衡［12］。

本研究检测了异种移植过程中LAIR-1的表达情况，结果显示，在异种移植术后发生免疫排斥反应的受体体内血浆中sLAIR-1的表达呈先下降后上升趋势，而mLAIR-1分子呈先上升后下降趋势。因此可以推测异种移植术后sLAIR-1和mLAIR-1表达量之间的动态平衡是通过竞争性结合相关配体，抑制受体体内淋巴细胞的活化，维持异种移植免疫平衡状态。

综上所述，NK细胞表面抑制性受体LAIR-1对异种移植术后免疫排斥反应的发生有一定的抑制作用。因此，深入探讨LAIR-1在异种移植中的作用机制，期望能够为异种移植术后诱导免疫耐受提供新的思路。