环介导等温扩增技术的研究与应用

洪颖 段勇 徐秋月

doi：10.3969/j .issn.1007 -614x.2018.5.1

摘要 本文介绍环介导等温扩增技术（LAMP）原理、特点及应用前景。因LAMP具有特异性高、灵敏度高、易操作、污染风险低的特点，因而目前在传染病、真菌、细菌，检测领域中作为诊断工具得到了认可。

关键词 环介导等温扩增技术；研究；应用

环介导等温扩增技术（LAMP）是在20世纪90年代核酸扩增技术研究及应用基础上，逐渐提出并广泛应用的一种新的技术方式，它在实际应用中能够根据靶基因6个不同区域进行4种特异引物设计，并通过恒温环境以链置换DNA聚合酶为反应条件，实现核酸扩增反应。在反应过程中，该技术不需要进行长时间温度循环以及紫外观察、模板热变性等较为繁琐的反应过程，具有简单、快捷以及特异性突出等技术特点，在生命科学研究以及相关领域中具有较广泛的应用价值[1]。

环介导等温扩增技术及其原理分析

LAMP在进行DNA扩增过程中，主要通过进行4种不同特异性引物设计，实现靶基因的6个特定区域识别，同时在恒温条件下完成扩增反应[2]。值得注意的是，环介导等温扩增技术在进行DNA扩增过程中能够将基因扩增与产物检测同步实现，并且扩增反应的效率较高，一般15～ 60 min左右就能够实现109～1 010倍基因扩增，并且该技术的特异性比较突出，对于靶基因序列的检测，能够只利用有无扩增产物进行判断与识别，具有较为突出的技术特征与优势。

引物的设计：环介导等温扩增技术在扩增反应应用中，其引物设计主要是结合靶基因3端Flc、F2c、F3c区以及5端Bl、B2、B3区共6个不同区域进行4种特异性引物设计，即FIP、F3、BIP、B3共4种特异性引物例。其中，FIP属于上游内部引物，主要构成于F2区，该区域和靶基因的3端F2c区一级5端Flc区分别呈互补与相同关系；而F3引物则为上游外部引物，主要构成于F3区域，该区域和靶基因中的F3c区域呈互补关系；同时，BIP引物为下游内部引物，B3引物为下游外部引物，它们分别构成于靶基因的B2、B3区域，与靶基因的B2c、Blc、B3c区域呈互补或序列相同关系。环介导等温扩增技术中的靶基因区域与引物设计关系图，见图1。

环介导等温扩增技术进行DNA扩增反应，主要是根据DNA在恒温（约65℃）环境下的动态平衡状态，其包括启动和循环两个阶段：靶基因Flc和Fl互补，靶基因F2和F2c、 F3c和F3、B3c和B3、B2c和B2、Blc和Bl互补。F2和Flc组成了FIP，Blc和Bl互补成BIP；LF是正向环引物，可结合于Fl和F2之间的环结构，使反应速度加快；而作为反向环引物的LB，可结合于Bl和B2之间的环结构，使反应速度加快。启动阶段时间很短，分子结合复制过程是由核酸等温扩增通过全部6段特异序列来识别靶DNA，这6段特异序列来自4条特异引物，正常核酸扩增启动的条件是这6段特异序列完全匹配。在全面扩增的时间中，循环阶段达>95%，对靶DNA识别依靠的是4段特异序列（FIP，BIP，LF和LB），只有这4段特异序列完全匹配才能进行互补，进行不断循环扩增，这样就保证了核酸等温扩增的特异性与准确性，见图2。

LAMP的产物分析：LAMP扩增产物是通过目测浑浊度、离心后对沉淀荧光染料进行观察和电泳这几种方式来检测。LAMP扩增副产物为白色沉淀，即焦磷酸镁，其可肉眼观察。而LAMP反应中焦磷酸镁沉淀的形成与所产生的扩增片段的量之间呈线性关系。因此对靶基因是否存在的判断通过观察反应中白色沉淀的有无即可。LAMP荧光检测试剂中的钙黄绿素初始与锰离子结合以产生骤冷效应。副产物的焦磷酸根与锰离子结合并从钙黄绿素上带走锰离子使其产生荧光，肉眼即可明显观察到。由此管内出现荧光即表明目标基因被大量扩增。LAMP产物也可使用琼脂糖凝胶电泳检测形成一组梯状带。

环介导等温扩增技术的应用研究

LAMP技术的发展与研究近年最主要在两个方面：首先是在临床上的实际应用；其次是原有技术的不断改进。所以LAMP被发明以来许多的实验人员将其应用于各种病原体的检查并与各种PCR的方法进行比较。因LAMP具有短时间内大量扩增相应的靶序列且不需要特殊的精密仪器及实验室场地，故被广泛应用在各种病原生物体及相关的疾病诊断上[4]。

传染性疾病检测的应用及研究：当前通过LAMP技术方式实现的病毒检测项目主要包括乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、流感病毒以及腮腺炎病毒、麻疹病毒、SARS冠状病毒等[5]，同时，有研究显示，在以环介导等温扩增技术以及聚合酶链反应两种不同方式进行7种不同类型的人类疱疹病毒DNA扩增反应中，以焦磷酸镁浊度检测方式进行检测显示，30 min的环介导等温扩增反应灵敏度约为500拷贝/管，而60 min的灵敏度达到250拷贝/管，并且只有HHV-7的DNA底物在反应中生成环介导等温扩增产物，其余情况均不能发现相应的反应产物[6]。并且其敏感的极限与PCR法比较可达到10的拷贝数。由此可见，环介导等温扩增检测在传染性疾病检测中能满足快速检测的要求。

细菌检测的应用：LAMP首先是以16sRNA这段保守序列作为靶基因，成功的设计出可同时检测肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌和无乳链球菌的引物[7、8]，因LAMP的高度特异性，故这4种细菌与其他的细菌都不会发生交叉反应。而对于结核分枝杆菌，LAMP可从口痰中鉴定出来，操作非常的（简单）方便，仅仅将所有的混合反应物放于63℃孵育，并在反应的试管中加入SYBR Green I，若有扩增产物则呈绿色。并且LAMP无论是在固体培養基还是液体培养基中都能培养出结核分枝杆菌，大大缩短了传统鉴定结核杆菌的时间。

真菌检测的应用：肺孢子菌是一种具有宿主特异性的机会感染致病菌[9]，引起的肺孢子菌肺炎（PCP）临床体征不明显且病原学诊断不特异，据相关文献报道用LAMP的方法检测PCP患者的口痰及肺泡灌洗液的肺孢子菌的检出率远远高于PCR的方法。

环介导等温扩增技术作为一种新的核酸扩增方法，本身具有较突出的特异性强的优势，并且在反应的初期，核酸扩增仪6n倍量进行扩增，30～ 60min即可扩增出109～1 010拷贝的目的基因来，具有高效的灵敏度，比传统的PCR高出2～3个数量级，并且结果判定肉眼即可完成。在病毒和细菌容易变异的今天，LAMP技术可最大程度满足临床快速诊断需要。随着LAMP技术的不断完善和改进，相信LAMP技术会在快速检测感染性疾病方面有着更为广阔的前景。

参考文献

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[2] Nagamine K， Hase T， Notomi T. Acceleratedreaction by loop-mediated isothermal ampli-fication using loop primers[J].Mol CellProbes，2002，16（3）：223-229.

[3]许苗，叶文武，王淑琛，等.快速检测马铃薯干腐病病原接骨木镰孢的环介导等温扩增技术[J].植物病理学报，2017，12（19）：1-9.

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[5]林瑶，朱雅君，叶军，等.环介导等温扩增技术及其在昆虫学领域的应用前景[J].上海农业学报，2014，30（5）：137-141.

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