肠道病毒5′-非翻译区测序分型的应用评估

唐诗欢 谢争华 刘朵朵 袁颖 陈满君 范笑地 丁细霞 余楠

510282广州,南方医科大学珠江医院检验医学部广东省突发传染病病原微生物重点实验室

肠道病毒(enterovirus，EV)属于小RNA病毒科肠道病毒属，有12个种(A-L)，150多个血清型[1]。EV是常见病原体，引起手足口病、脑炎和呼吸系统疾病等，不同血清型导致的疾病有所区别[2]。除国内主要流行的肠道病毒A组71型(EVA71)、柯萨奇病毒A组16型(cosackievirus A group 16，CoxA16)和6型(CoxA6)，以及引起呼吸道感染的肠道病毒D组68型(enterovirus D68，EVD68)外，其他血清型EV的感染情况、疾病特征、预后等，相关资料较少。EV血清型鉴定目前主要用于流行病学监测，临床实验室较少开展。

EV基因组为单股正链RNA，其中5’-非翻译区(5′-untranslated region，5′-UTR)基因序列高度保守，适合作检测靶标，用于EV初筛。衣壳蛋白 VP1(viral protein 1)、VP2、VP4决定了 EV 的抗原性，用于血清型分型[3-5]，其中VP1区分型与血清型完全对应，被认为是最准确的分型靶标[6]。一般无需病毒分离，可采用巢式逆转录PCR直接扩增、测序标本的病毒VP1区，缺点是操作繁琐，敏感度低，检出率约60%[7-8]。有学者认为5′-UTR对血清型区分有一定价值[9-10]，虽非分型首选方法，但敏感度高。5′-UTR分型对于国内流行的主要EV血清型的适用程度如何，目前较全面的评价资料不多。本研究利用近年确认的EV感染者呼吸道、肠道的临床标本600余例，比较5′-UTR与VP1区测序分型以及型特异性VP1区 RT-PCR检测结果，评价5′-UTR分型的性能，为其应用于EV血清型相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验标本 拭子采自就诊于南方医科大学珠江医院的有发热、出疹(手足疱疹、口腔溃疡等)、呼吸道症状(咳嗽、流涕、呼吸急促等)、神经系统症状(抽搐、惊厥、肌痉挛、昏迷等)等疑似EV感染的病例。采集后立即冰盒送至实验室，-80℃保存备用。2016年1月到2017年12月采集肛拭769份，2014年1月到2017年12月采集鼻拭2 416份，标本采集征得患者知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 核酸提取:采用 Viral RNA Mini Kits(Qiagen，德国)，按说明书操作。

1.2.2 EV初筛:采用EV通用型荧光定量PCR试剂(之江，中国)，筛查为阳性的标本纳入研究。按试剂盒说明操作和判断结果。

1.2.3 以5′-UTR区扩增比对分型(简称5′-UTR法):引物及反应条件来自文献[10-11]。

1.2.4 以VP1区扩增比对分型(简称VP1法):引物及反应条件来自文献[12]。

1.2.5 型特异性 RT-PCR:EVA71、CoxA16、CoxA6和CoxA10分别采用型特异性荧光定量PCR试剂盒，按说明操作。EVD68特异性巢式PCR引物及反应条件来自文献[13]。

1.2.6 测序分型:生工生物工程(上海)公司测序，序列在GenBank上比对，根据比对同源性的高低获得肠道病毒血清型。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0软件。采用2×2表格(对照方法/研究方法)分别计算灵敏性、特异性，卡方检验进行两个率的比较，kappa检验分析方法一致性。

2 结果

2.1 不同标本类型EV分型 769例肛拭和2 416例鼻拭经EV通用型核酸筛查为阳性的共有666例，分别是518例肛拭(阳性率67.4%)和148例鼻拭(阳性率6.1%)。进一步EV分型:5′-UTR法成功553例，VP1法成功318例 (83.0%Vs 47.7%，P＜0.001)。518例肛拭中，5′-UTR法分型成功434例，VP1法274例(83.8%Vs 52.9%，P＜0.001)；148例鼻拭中，5′-UTR法分型成功119例，VP1法44例(80.4%Vs 29.7%，P＜0.001)。

肛拭(VP1/5′-UTR至少1种)检出最多的5种血清型分别为:CoxA6(217/518，41.9%)、CoxA16(88/518，17.0%)、EVA71(40/518，7.7%)、CoxA10(28/518，5.4%)和 CoxA4(27/518，5.2%)；鼻拭检出率最高的血清型为EVD68(15/148，10.1%)。由于两种方法对部分鼻拭中的EV仅能区分为鼻病毒A、B、C组，故不再分析对鼻病毒血清型的分型性能。

2.2 以VP1法为对照的5′-UTR法分型性能评估以VP1法为参考，5′-UTR法对不同血清型的分型性能有差别。肛拭主要检出的5种血清型中，5′-UTR法对CoxA6、EVA71和CoxA10的灵敏性较好(91.3～93.3%)，CoxA4较差(70.6%)，CoxA16最差(57.1%)；对EVA71、CoxA10和CoxA4的特异性很好(97.4% ～98.1%)，CoxA6和 CoxA16其次(84.3% ～86.5%)；两种分型方法对 EVA71和CoxA6一致性较好(kappa值 0.706～0.847)，CoxA10和 CoxA4一般(0.601～0.654)，CoxA16最差(kappa值0.188)。 对于鼻拭检出的 EVD68，5′-UTR法灵敏性为100.0%，特异性为91.1%，但两种方法一致性差(kappa值0.217)，见表1。

2.3 以VP1法结合型特异性RT-PCR为对照的5′-UTR法分型性能评估 对5′-UTR法分型阳性而VP1法阴性的标本，进一步采用型特异性RT-PCR验证，分别有 CoxA6(51/56)、CoxA16(41/67)、EVA71(6/9)、CoxA10(13/13)和 EVD68(10/13)得以确认。以VP1法结合型特异性RT-PCR为参考，5′-UTR法对上述血清型的灵敏性分别提高为:93.4%、85.5%、97.2%、96.4%和100.0%，特异性提高为98.4%、94.3%、99.4%、100.0%和97.8%，两种方法一致性好(kappa值0.713～0.981)，见表2。

表1 肠道病毒5′-UTR分型的诊断性能Tab.1 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV compared with VP1 serotyping

表2 对照肠道病毒VP1区分型和型特异性RT-PCR的5′-UTR分型性能Tab.2 Diagnostic performance of 5′-UTR serotyping for EV

3 讨论

我国EV感染人数居高不下，仅手足口病，2012年至2017年，年报告达182.8万 ～277.9万例。CoxA16和 EVA71为常见的血清型，近年 CoxA6、CoxA10出现增多趋势[14-15]。曾在欧美引起严重呼吸和神经系统疾病的EVD68，近年也在亚洲多个地区有所报道[13，16-17]。不同血清型EV引起的疾病有差别，各型间无交叉免疫力，因此，准确、高效的EV血清型鉴定不论对临床诊治还是疾控监测，均有意义。

传统的EV血清型鉴定依赖病毒分离及中和试验，方法耗时、昂贵。VP1蛋白包含主要的中和抗原决定簇，序列可用于血清型鉴定，但针对VP1区的简并引物难适应复杂变异，扩增效率低，不同血清型检出率差异大[18]。5′-UTR分型具一定敏感度和特异性[9]，Ge等人[9]以型特异性RT-PCR为对照，采用5′-UTR分型方法检测了4种血清型、40份临床样本，认为分型结果可接受。该法对我国近年EV流行株分型性能的评价资料有限，本研究纳入近四年的临床样本，涵盖更多血清型，评价可更客观。

针对5′-UTR 设计的方法有多种[9，11]，本研究所用方法最早用于鼻病毒分型[10]，后有学者将其应用于EV分型，也有较好效果且操作简便[11]。本研究发现，除 CoxA16外，该法对 CoxA6、EVA71、CoxA10和EVD68等几种主要血清型的分型能力较好。VP1分型方法也有多种，本研究采用的方法[12]自2006年发表以来，为全世界众多实验室采用，本实验室前期也小样本量比较了几种类似方法，因该法成功率略高而沿用。

对于两种样本类型，5′-UTR法的分型成功率均较VP1法高。影响分型效果的主要是方法设计，如简并引物对目标区域的匹配度、不适应复杂变异等，其次可能与病毒载量有关。Kiang等[10]以VP4/VP2分型为参考，考评5’-UTR分型，发现两种方法对病毒液的分型成功率高且一致性好，对临床标本则VP4/VP2扩增效率很低，而5’-UTR能成功扩增分型，推测与病毒载量有关。本研究也发现即使同一标本，两种方法扩增亦有差别。

为确认5′-UTR法诊断阳性而VP1法诊断阴性的这部分结果源自前者的非特异性还是后者的低敏感度，本研究采用型特异性RT-PCR鉴定，分析显示各血清型EV的诊断敏感度和特异度均有提高，提示两种方法不一致主要是VP1法低敏感度低导致。CoxA4由于例数较少，未对该型进一步验证。

综上，5′-UTR法对EV血清型的诊断效果尚可。即使样本来自同一部位，如肛拭，其对不同血清型EV的诊断性能也有差异，因此应用时，应根据研究目的综合考虑。对于临床感染病例的研究，可考虑5′-UTR初步分型加型特异性RT-PCR确认的思路。

利益冲突 无