FAK、VEGF-C和LMVD联合检测判断直肠癌组织中淋巴管生成的临床意义

徐永良 张大伟 赵毅玲 冯克俭 孙 平

(牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

直肠癌是发病率仅次于胃癌和食管癌的消化系统常见的恶性肿瘤，且近年来发病率逐年升高〔1,2〕。早期直肠癌以淋巴转移为主〔3〕。淋巴管生成决定是否发生直肠癌淋巴道转移，直肠癌细胞能够通过局部淋巴管扩散到达远处器官，进而对直肠癌患者的预后产生影响〔4〕。因而，通过检测淋巴管的生成预测直肠癌患者的预后具有重要的临床意义。黏着斑激酶(FAK)属于非受体酪氨酸激酶成员之一，在转导过程中发挥整合素介导信号的作用，FAK的活化与肿瘤细胞的侵袭和转移有着密切关系〔5〕。血管内皮生长因子(VEGF)-C是由肿瘤细胞分泌的一种特异性的促淋巴管生成因子，通过与特异性受体结合诱导淋巴管的生成〔6〕。微淋巴管密度(LMVD)是显示淋巴管数量预测肿瘤是否发生淋巴结转移的重要参数之一。本研究通过免疫组化方法检测直肠癌组织内FAK、VEGF-C和LMVD的表达，探讨三种蛋白表达的联合检测评估对直肠癌淋巴管生成临床判定的重要性。

1 资料与方法

1.1病例资料 选取2014年5月至2015年5月牡丹江医学院红旗医院胃肠外科收治的直肠癌患者83例，男52 例,女31例，年龄33～76岁。其中高分化腺癌6例，中分化腺癌24例，低分化腺癌53例；浆膜受侵45例,未受侵38例； 52例有淋巴结转移，31例无淋巴结转移；Dukes分期:A、B、C、D期分别有12例，17例，36例，18例。对照组83例为直肠癌术后距肿瘤边缘5～10 cm的正常组织。

1.2检测各蛋白表达 FAK兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司)；VEGF-C、D2-40鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠及羊抗兔二抗试剂盒、防脱载玻片、二氨基联苯胺(DAB)显色剂(福州迈新生物技术公司)。所有标本甲醛固定、石蜡包埋、4 μm厚度连续切片，SP染色步骤按试剂盒说明书操作。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判断 细胞质呈棕褐色为D2-40阳性表达，胞质内浅黄色至棕褐色染色时为VEGF-C和FAK 阳性表达。在3个不同的200倍光镜视野下对切片进行分析，半定量计分法判定：①按细胞质染色程度评分：无着色且与背景颜色一致为0分；略高于背景颜色的浅黄色为1分；显著高于背景颜色的棕黄色为2分；棕褐色为3分。②以阳性细胞所占比例为依据进行评分：阴性为0分；≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。③以阳性着色程度与阳性细胞所占比例的乘积为依据进行评分：(-)0～2 分，(+)3～4 分，()5～8 分，()9～12 分。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件进行t及χ2检验，相关性分析采用Spearman秩和检验。

2 结 果

2.1组织D2-40标记LMVD结果 直肠组织D2-40阳性染色微淋巴管形态大小不一，壁较薄，其 LMVD 为(3.9±2.5)；直肠癌组织中明确可见 D2-40 阳性染色微淋巴管，其 LMVD 为(8.3±2.1)，二者差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2直肠癌组织中FAK和VEGF-C表达与临床病理特征的关系 83例直肠癌中有55例(66.27%)VEGF-C 呈阳性表达，免疫反应物质表现为直肠癌细胞胞质内棕黄色颗粒染色，背景不着色；VEGF-C 蛋白的表达与直肠癌患者淋巴结转移和 Dukes 分期显著相关(P<0.01)。FAK 在83例直肠癌中有67例(77.91%)呈阳性表达。主要呈弥漫性或颗粒状棕黄色位于直肠癌细胞胞质内。FAK 的表达与直肠癌的Dukes 分期和淋巴结转移均密切相关(P<0.01)，而与肿瘤浸润深度、分化程度、患者年龄、性别均无关(P>0.05)。见表1。

2.3直肠癌 LVMD与FAK、VEGF-C表达的相关性 83例直肠癌标本中,LVMD>8.13为高LVMD组。在直肠癌组织中高LMVD与 FAK和VEGF-C的表达均为正相关(P<0.05)，见表2。

表1 直肠癌VEGF-C和FAK的表达与临床病理特征的关系(n)

与相应的亚组比较：1)P<0.01

表2 直肠癌LMVD与FAK、VEGF-C表达的相关性(n)

与低LMVD组比较：1)P<0.01

3 讨 论

直肠癌转移早期就会出现淋巴结转移。由于直肠癌淋巴结转移中淋巴管生成发挥巨大作用，逐渐获得了越来越多的重视和了解。淋巴管的结构和形态与血管相似，二者常相伴生长，加大了区分的难度。因此，淋巴管管腔的识别及生物学特性的判定对研究肿瘤淋巴结转移具有重要的意义。淋巴管内皮细胞培养技术随着淋巴管内皮细胞分子标志物的发现而逐渐提高，肿瘤淋巴管生成作为独立的研究领域，正逐渐成为关注的热点〔3，7〕。FAK是一种对细胞外基质成分和肿瘤细胞的黏附、信号转导均有一定的影响的蛋白质〔8，9〕。VEGF-C是一种能与VEGF受体(VEGFR)-3结合的特异性淋巴管内皮细胞调节因子，其具有介导和启动受体的酪氨酸激酶信号系统，调节淋巴管生成的作用〔10〕。D2-40是目前公认的标记淋巴管管腔的特异性标记物，其显示的LMVD常用来研究淋巴管生成在肿瘤淋巴结转移中的作用。本研究结果显示FAK和VEGF-C均高表达于直肠癌组织细胞质内。两者的高表达均与直肠癌患者淋巴结转移及Dukes 分期密切相关，并且FAK和VEGF-C的表达与LMVD表达也具有明显的相关性，都提示联合检测FAK、VEGF-C和LMVD的表达对判断直肠癌内淋巴管生成具有重要价值。这将有利于对直肠癌淋巴结转移分析和患者的预后进行评估，为临床寻找特异性靶点抑制直肠癌淋巴结转移提供理论依据。