有氧运动对APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织Keap1/Nrf2信号通路的影响

房国梁 赵杰修 张漓 李鹏飞

国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种多发于老年人，以进行性认知功能障碍和记忆力衰退为主要临床特征的神经系统退行性疾病[1]。AD的致病原因众多，如β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）积聚、微管相关蛋白tau异常磷酸化以及钙平衡失调等等。目前越来越多的研究表明氧化损伤也是导致AD发生的重要原因[2]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成机体氧化损伤的主要物质，它是由线粒体产生的一类含氧的单电子还原产物。随着年龄的增长ROS逐渐积累，对机体的氧化损伤程度不断加深[3]。研究发现AD患者脑中ROS含量明显增加[4]，ROS可以激活β-分泌酶1（Beta-secretase 1，BACE1）和γ-分泌酶，使β-淀粉样前体蛋白（amyloid β-protein precursor，APP）通过淀粉样蛋白途径降解，导致Aβ含量增多[5]；同时ROS还能激活相关蛋白激酶，导致tau蛋白过度磷酸化产生神经纤维缠结（neurofbrillary tangles，NFTs）[6]；另一方面，Aβ和NFTs又可以诱导ROS的生成和线粒体功能障碍，产生更多的ROS[7]；这些都加速了AD的产生。

而Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/核因子 E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2 p45-related factor 2，Nrf2）信号通路在机体抗氧化反应中发挥关键作用[8]。正常生理条件下，Nrf2与Keap1相偶联，经泛素化修饰后被蛋白酶体快速降解[9]。而在氧化应激条件下，Keap1与Nrf2的DLG基序解偶联，但仍与ETGE基序结合，导致Keap1构象发生改变，抑制了Nrf2的泛素化降解过程；使Keap1与Nrf2的结合处于饱和状态，而不断合成的Nrf2转入细胞核内与肌腱纤维瘤蛋白（muscloaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf）形成异源二聚体，促使Nrf2识别并结合抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），启动下游抗氧化蛋白基因的转录和翻译，以增强机体抗氧化能力[10]。

大量研究表明，长期有规律地体育运动能够有效延缓AD的发生，但是其机制尚不明确。有氧运动在改善大脑功能、延缓AD发生过程中，是否通过影响Keap1/Nrf2信号通路发挥积极作用，目前国内外尚无人报道。因此，本研究通过观察8周有氧运动后APP/PS1转基因小鼠大脑皮质和海马组织中Keap1/Nrf2信号通路各因子的变化情况，阐明有氧运动对Keap1/Nrf2信号通路及脑内氧化应激水平的影响，为揭示有氧运动改善大脑功能、延缓AD发生提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组

实验选用24周龄雄性APP/PS1转基因小鼠20只，体重为28.68±3.44 g，购自北京中科泽晟科技有限公司。随机分为安静对照组（CG，n=10）和运动组（EG，n=10）。每笼2只小鼠，自由进食饮水，光照比为12 h∶12 h，温度20 ±2℃，相对湿度40～60%。APP/PS1转基因小鼠是一种广泛使用的AD模型小鼠，可表达突变的人类早老素（DeltaE9）和人鼠淀粉样前蛋白（APPswe）融合体，导致早发性老年痴呆症，6～7月龄APP/PS1小鼠脑内即可检测到β淀粉样蛋白沉淀的形成[11]。

1.2 训练方案

适应性饲养1周后，所有小鼠先进行1周的适应性跑台训练，速度为9 m/min，每天训练10 min，连续训练5天。休息2天后，EG组小鼠按表1中的方案进行8周跑台训练。跑台坡度为0，每周一至周五训练，周六、日休息2天。而CG组小鼠则一直处于安静状态。

表1 8周跑台训练方案

1.3 样品制备

在最后一次训练结束后48 h，所有小鼠用10%水合氯醛溶液腹腔麻醉，然后断头取脑，在冰上迅速分离相同部位大脑皮质和两侧海马组织，放入液氮冷冻。然后将样品转入-80℃冰箱中保存待测。由于小鼠脑组织较小，每组随机取其中5只的样品进行氧化应激水平检测及荧光定量PCR实验，另外5只的样品进行Western blot实验。

1.4 氧化应激水平检测

测定小鼠大脑皮质和海马组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量，以及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）的活力。所有操作均按照碧云天生物技术有限公司生产的试剂盒说明书进行。

1.5 荧光定量PCR实验

将小鼠大脑皮质和海马组织分别放入冰预冷的玻璃匀浆器中，然后加入1 ml Trizol裂解液，充分匀浆，使组织细胞裂解，采用氯仿异丙醇法提取大脑皮质和海马组织总RNA，利用逆转录酶逆转录得到cDNA。然后利用各目的基因序列设计特异性引物，进行荧光定量PCR实验。引物序列见表2。最后根据各反应孔的ct值，计算各组目的基因的相对表达量。

表2 引物合成序列

1.6 Western blot实验

将小鼠大脑皮质和海马组织在液氮中研磨后，迅速加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液进行细胞组织的充分裂解。4℃，12000×g离心15 min，取200 μl上清液然后加入50 μl 5×蛋白上样缓冲液，放入100℃水浴锅中进行蛋白变性，持续10 min。然后进行SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭膜1 h，然后将膜与稀释好的一抗4℃孵育过夜（实验中用到的一抗APP、Aβ42、BACE1、Nrf2、Keap1、Maf、HO-1、NQO1和GCLC抗体均购自Abcam公司；β-actin抗体购自碧云天公司）。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，洗去残留一抗，然后将膜与稀释好的二抗室温孵育1 h（实验中用到的二抗HRP标记山羊抗兔 IgG和HRP标记山羊抗小鼠IgG购自Beyotime公司），然后用TBST洗膜4次，每次5 min，以洗去残留的二抗。最后使用ECL化学发光试剂和X光片检测蛋白信号。

1.7 灰度分析及数据统计

使用ImageJ软件进行Western blot条带的灰度分析，应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，文中所有统计数据为3次独立实验结果的平均值±标准差，显著性检验选择双尾t检验。P＜0.05表示有显著性差异；P＜0.01表示有非常显著性差异。

2 结果

2.1 有氧运动增强APP/PS 1小鼠大脑皮质和海马组织Keap 1/Nrf 2信号通路活性

通过荧光定量PCR实验发现，EG组小鼠大脑皮质和海马组织中Keap1 mRNA水平与CG组相比并无显著性变化（图1A）；但EG组Nrf2和Maf的mRNA水平显著高于CG组，其中Nrf2为CG组水平的2.36倍和2.75倍（P＜0.01，图1B），Maf为CG组水平的1.96倍和2.13倍（P＜0.01，图1C）。Western blot方法检测小鼠大脑皮质和海马组织中Keap1、Nrf2和Maf的蛋白水平发现，EG组Keap1的蛋白水平与CG组相比同样无显著性变化（图1D、E）；而EG组Nrf2和Maf的蛋白水平显著高于CG组，其中Nrf2为CG组水平的1.61倍和1.75倍（P＜0.01，图1D、F），Maf为CG组水平的1.52倍和1.65倍（P＜0.01，图1D、G）。上述结果说明8周有氧运动后APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中Nrf2和Maf在转录和翻译水平显著提高，从而增强了Keap1/Nrf2信号通路的活性。

图1 各组小鼠Keap1、Nrf2和Maf的mRNA和蛋白水平比较

2.2 有氧运动提高Keap 1/Nrf 2信号通路下游抗氧化蛋白含量

如图2所示，EG组小鼠大脑皮质和海马组织中血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、NADPH醌氧化还原酶1（NADPH dehydrogenase quinone 1，NQO1）和谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）的mRNA水平均显著高于CG组，其中HO-1为CG组水平的3.22倍和3.67倍（P＜0.01，图2A），NQO1为CG组水平的2.83倍和3.26倍（P＜0.01，图2B），GCLC为CG组水平的2.46倍和2.80倍（P＜0.01，图2C）。EG组小鼠大脑皮质和海马组织中HO-1、NQO1和GCLC的蛋白水平也都显著高于CG组，其中HO-1为CG组水平的2.36倍和3.10倍（P＜0.01，图2D、E），NQO1为CG组水平的2.61倍和2.95倍（P＜0.01，图2D、F），GCLC为CG组水平的1.71倍和1.84倍（P＜0.01，图2D、G）。上述结果说明8周有氧运动能够显著提高Keap1/Nrf2信号通路下游抗氧化蛋白含量，从而提高大脑皮质和海马组织抗氧化能力。

图2 各组小鼠HO-1、NQO1和GCLC的mRNA和蛋白水平比较

2.3 有氧运动降低APP/PS 1小鼠大脑皮质和海马组织氧化应激水平

如图3所示，EG组小鼠大脑皮质和海马组织中MDA含量显著低于CG组（P＜0.05，P＜0.01，图3A），而GSH含量显著高于CG组（P＜0.01，图3B），同时GSHPx（P＜0.05，图3C）和T-SOD（P＜0.05，图3D）的酶活力也显著高于CG组。上述结果说明Keap1/Nrf2信号通路下游抗氧化蛋白含量的提高，能够显著降低APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织的氧化应激水平。

2.4 有氧运动降低AP/PS 1小鼠大脑皮质和海马组织Aβ蛋白水平

通过Western blot实验发现，EG组小鼠大脑皮质和海马组织中APP的含量与CG组相比并没有显著差异（图4A、B）；而Aβ42的含量显著低于CG组，分别约为CG组水平的53.0%和45.1%（P＜0.01，图4A、C）；EG组BACE1的含量也显著低于CG组，分别约为CG组水平的41.1%和45.2%（P＜0.05，图4A、D）。上述结果说明8周有氧运动降低了APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中BACE1的含量，减少了APP通过淀粉样蛋白途径降解，从而有效降低了Aβ蛋白水平。

图3 各组小鼠MDA和GSH的含量及GSH-Px和T-SOD的酶活力

图4 各组小鼠APP、Aβ42和BACE1的蛋白水平比较

3 讨论

氧化损伤是导致AD发生的一个重要因素，随着年龄的增长ROS在体内不断积累，对机体氧化损伤逐渐加深[3]。大量研究表明AD患者脑中ROS含量与正常人相比显著增加[4]。ROS可以激活β-分泌酶和γ-分泌酶，使APP通过淀粉样蛋白途径降解，增加Aβ含量[5]。此外，ROS还可与脂类和蛋白质等物质反应，其产物会导致神经元细胞凋亡[12]。这些都加速了AD的产生。

Keap1/Nrf2信号通路对机体氧化应激反应具有重要调控作用，并且该信号通路的激活对延缓AD有积极作用。研究发现AD模型小鼠脑中Nrf2、NQO1和GCL等抗氧化酶的mRNA水平降低，Aβ积聚增加[13]。同时在AD患者脑中也发现Nrf2含量与正常人相比显著下降[14]。而Kanninen等[15]向AD模型小鼠海马组织中注射编码Nrf2的慢病毒载体，6个月后发现小鼠空间学习记忆能力明显改善，并且编码Nrf2、HO-1的mRNA含量增加。此外，通过体外培养野生型和Nrf2缺陷型小鼠胚胎神经干细胞，并在野生型干细胞中过表达Nrf2，发现Nrf2过表达能够抑制Aβ蛋白诱导的神经毒性，而在Nrf2缺陷型干细胞中Aβ诱导减少神经分化的程度加重[16]。上述研究均表明Keap1/Nrf2信号通路的激活能够提高神经元细胞的抗氧化能力、减轻神经氧化损伤，从而延缓AD进程。

越来越多的研究表明，有氧运动可以减少体内氧化自由基的产生，提高机体抗氧化能力[17，18]，并对延缓大脑衰老、防治AD具有积极作用[19-21]。但是在上述过程中Keap1/Nrf2信号通路是否在其中发挥关键调控作用，目前国内外尚无人报道。

我们在本研究中选取了大脑皮质和海马组织两种具有不同结构和功能的脑组织进行了检测。大脑皮质位于大脑的表层，是机体的最高级神经中枢，控制着听觉、视觉、触觉、情感、抽象思维、语言、判断和躯体运动等多种高级功能[22]；海马组织位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，负责信息存储，控制着学习与记忆[23]。这两种脑组织是AD病变最为显著的区域，表现为老年斑的出现[24]、NFTs的形成[25]和神经元的大量丢失等。实验发现，8周跑台训练后APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织中Keap1在转录和翻译水平并没有发生显著变化，而Nrf2和Maf在转录和翻译水平均显著提高，从而增强了Keap1/Nrf2信号通路的活性。由于该通路活性的增强其下游抗氧化蛋白HO-1、NQO1和GCLC在转录和翻译水平也显著上升，从而提高了大脑皮质和海马组织抗氧化的能力。另外，通过试剂盒检测发现MDA的含量明显下降，GSH的含量明显上升，GSH-Px和SOD的酶活力显著提高，也验证了大脑皮质和海马组织抗氧化能力的提高和氧化应激水平的降低。氧化应激水平的降低有效抑制了小鼠大脑皮质和海马组织中β-分泌酶的活性，表现为BACE1含量降低，从而减少了APP通过淀粉样蛋白途径的降解，最终降低了Aβ蛋白的形成。上述改变对于改善AD具有积极作用。此外，通过比较发现有氧运动对海马组织中Keap1/Nrf2信号通路的活性和下游抗氧化蛋白的影响更为显著。

4 结论

综上所述，有氧运动能够增强APP/PS1小鼠大脑皮质和海马组织Keap1/Nrf2信号通路活性，提高通路下游抗氧化蛋白含量，降低氧化应激水平，从而有效抑制Aβ蛋白的形成，对于改善阿尔茨海默症具有积极作用。