营养因子对非反刍动物肠道黏膜免疫的调控作用

梁 静 张文举 聂存喜* 寇莎莎

(石河子大学动物科技学院，石河子 832000)

黏膜直接接触外界，是免疫系统的第1道防线，承担着复杂的免疫任务，既要对有益共生微生物及食物耐受，又要对病原微生物入侵产生免疫。随着生物技术、分子生物学等的发展，黏膜免疫才重新被重视并迅速发展起来[1]。黏膜免疫是指机体与外界相通的腔道黏膜表面的免疫，该系统主要由胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道的黏膜及某些外分泌腺(如唾液腺、泪腺等)黏膜相关的淋巴组织组成。这些与外界相通的腔道黏膜是机体与外界相隔的最大屏障，也是病原体侵入机体的重要通道，因此黏膜免疫在机体免疫方面有着极其重要的地位[2]。黏膜免疫系统通过模式识别分子(PRRs)识别病原相关分子模式(PAMPs)产生免疫应答，清除病原，维持机体平衡。肠道黏膜中淋巴细胞迁移和细胞因子失衡可能主要涉及炎症性肠病的发病机理，包括肠过敏和克罗恩氏病。因饲粮成分与肠道黏膜的免疫功能密切相关，故关注饲粮控制对炎症性肠病治疗具有重要意义[3]。有研究指出，豌豆中含有的抗营养因子(anti-nutritional factors，ANF)会增加肉鸡肠上皮T细胞的数量，从而引起空肠的黏膜免疫反应。含有ANF的豆类间接影响肠道免疫系统，通过引起寡糖或非淀粉多糖发酵的增加而导致肠道微生物群落组成发生变化[4]。本文主要就肠道黏膜免疫系统组成结构、分类、主要免疫因子以及营养因子对肠道黏膜免疫的调控作用进行综述，旨在为营养素和非营养素对非反刍动物肠道免疫机能及其免疫调节作用机制提供参考。

1 肠道黏膜免疫系统组成结构

肠道黏膜免疫是机体防止感染的首道防线[5]。当肠道黏膜受到外界因素影响时，其免疫功能减弱，外来病原如细菌、病毒等易于侵入，导致机体消化不良、腹泻，甚至危及生命。肠道是消化食物、吸收营养物质的主要场所，同时肠道黏膜也是病原入侵的重要门户。黏膜免疫是宿主在长期进化中不断与病原作斗争形成的保护机制[3]。

肠道黏膜免疫系统是一种高度特异性的免疫系统，依据功能及分布特点，可将黏膜免疫系统的免疫细胞分成2个部分：一是肠道相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissue，GALT)，是免疫细胞的活化诱导部位；二是弥散免疫细胞，是免疫反应发生的效应部位。GALT主要包含微褶皱细胞(micro-fold cell，M细胞)、派伊尔氏结(Peyer’s patch，PP)等。弥散免疫细胞主要包含肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)、上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)和黏膜固有层淋巴细胞(lamina proprial lymphocyte，LPL)等[3,6]。

2 肠道黏膜免疫分类

肠道黏膜免疫屏障是迄今为止动物和人类最重要的屏障之一[7]。肠道黏膜免疫主要是在抗原刺激下产生的局部免疫反应，中和抗原物质，以避免机体本身受到损伤。在功能上，肠道黏膜屏障是通过黏液层、肠细胞和紧密连接的协作防御病原体入侵的第1道自然线[8]。肠道黏膜免疫分为先天性免疫和适应性免疫。先天性免疫主要由先天性免疫细胞执行。适应性免疫主要通过肠道免疫细胞聚集区，即皮尔氏小体三级淋巴组织执行。

2.1 肠道黏膜先天性免疫

2.1.1 肠道黏膜上皮细胞

肠道黏膜上皮细胞除了构成天然机械屏障外，还通过PRRs识别病原及其分泌的毒素产生先天性免疫应答，加强对病原微生物的杀伤和清除作用。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)与NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)在黏膜上皮细胞免疫应答中起重要作用[3]。

2.1.2 单核吞噬细胞和树突状细胞(DC)

2.1.3 先天性淋巴细胞(innate lymphoid cells，ILC)

ILC是由淋巴前体细胞分化形成的，与常规淋巴细胞不同的是，该细胞不含有基因重组产生的抗原受体。ILC可分为3个亚群：1)ILC-Ⅰ表达转录因子T-bet，主要分泌干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；2)ILC-Ⅱ表达GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3，GATA3)，主要分泌IL-5和IL-13；3)ILC-Ⅲ表达维甲酸孤儿核受体γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)，主要分泌IL-17和IL-22[3]。

2.2 肠道黏膜适应性免疫

3 肠道黏膜免疫的主要因子

3.1 sIgA主导肠道黏膜免疫功能的正常发挥

作为机体的第1道免疫屏障，黏膜免疫在机体免疫系统中具有特殊地位[10]。肠道黏膜屏障能防止肠腔内有害物质穿过肠道黏膜进入体内其他组织器官和血液循环，而以sIgA为主的体液免疫是肠道黏膜屏障中的重要部分，是肠道黏膜免疫屏障的主要免疫球蛋白，具有强化肠道免疫屏障、阻止肠道病原体入侵等生物学功能，为病菌在肠道黏膜黏附和定植的重要防御前线[11-12]。sIgA是由2个或更多IgA单体聚合而成，一般由2个IgA单体、1条J链和1条分泌片(secretory component，SC)构成。

微生物引起感染的先决条件是黏附在黏膜组织上，因而抑制微生物黏附是黏膜免疫最主要的保护功能之一。sIgA可阻止病原微生物黏附于黏膜上皮细胞表面，其作用机制可能是：1)sIgA使病原微生物发生凝集，从而丧失活动能力而不能黏附于黏膜上皮细胞；2)sIgA与微生物结合后，阻断微生物表面的特异结合位点，从而丧失黏附能力；3)sIgA与病原微生物抗原结合成复合物，从而刺激消化道等黏膜的杯状细胞分泌大量黏液，“冲洗”黏膜上皮，达到阻止微生物黏附的作用。sIgA可有效中和黏膜上皮内的细菌、病毒、毒素和酶等有害物质，捕捉黏膜内层病原体，形成免疫复合物排出。黏膜局部特异性存在sIgA，使黏膜暴露于外界可溶性抗原后可以减少相应抗原的吸收，同时对不相关的抗原无影响。sIgA可增强乳杆褐质及乳过氧化物酶系统对几种黏膜病原体的抗菌作用，可通过黏膜淋巴组织增强抗体依赖性细胞的功能，并能武装腔中淋巴细胞，从而提高直接杀菌能力，分泌液中的抗菌物质如乳铁传递蛋白、溶菌酶等有协同作用。sIgA抗体可结合M细胞，并经过M细胞运输至黏膜淋巴组织，该运输过程可使sIgA或sIgA抗原复合物与淋巴细胞或抗原呈现细胞反应，露出sIgA结合位点[2,13-14]。

3.2 细胞因子对肠道黏膜免疫屏障的关键性调节作用

肠道黏膜免疫屏障可产生多种细胞因子，包括淋巴因子、趋化因子、生长因子(GF)、TNF、IL、IFN等。细胞因子种类繁多，所表现的不同调节作用与其本身浓度、微环境等密切相关，近年来研究较多的细胞因子有IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IFN-γ、TNF-α等。

4 营养因子对肠道黏膜免疫的调节作用

肠道黏膜免疫屏障受到不同营养因子的影响，肠道黏膜免疫的维持需要肠腔中营养物质的滋养。某些底物如谷氨酰胺(glutamine，Gln)、精氨酸、短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)、核苷酸等均对肠道黏膜免疫起到重要的调控作用。

4.1 Gln

Gln是动物体内含量最丰富的氨基酸之一，为条件性必需氨基酸，可作为反映动物机体免疫功能强弱的一个重要指标[16]，Gln可减轻急性重症胰腺炎肠道黏膜屏障功能损伤，抑制炎症反应的激活[17]。Gln是肠道黏膜上皮细胞和淋巴细胞的重要能量供体，是肠道上皮细胞的一种主要的能量底物[18]。Gln也可作为嘌呤、嘧啶的合成前体，对免疫细胞的增殖有重要作用。当机体受到外伤、感染、疲劳等严重应激时，肠道黏膜上皮细胞内的Gln很快耗竭；当肠道缺乏食物、消化液等刺激或缺乏Gln时，肠道黏膜萎缩，绒毛变稀、变短甚至脱落，隐窝变浅，肠道黏膜通透性增加，肠道免疫功能受到损害。Gln可提高动物的生产性能，同时具有维护肠道黏膜屏障等重要功能[19]。有研究表明，补充Gln可有效保护晚期胃癌患者的围手术期化疗的肠道黏膜屏障功能，对提高晚期胃癌患者基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性、增强免疫功能、降低发病率等具有显著的临床应用价值[20]。补充丙氨酸(Ala)-Gln可增加高原训练大鼠肠道组织中IL-4、TGF-β含量以及多聚免疫球蛋白受体(poly-immunoglobulin receptors，PIGR)、J链的mRNA表达量，促进sIgA的合成与分泌，减缓高原训练引起的肠道体液免疫功能损伤[21]。Dong等[22]研究发现，饲粮中添加0.8% Gln可显著改善蛋鸡十二指肠和输卵管的发育，并显著提高产蛋率。Gln可为快速分裂细胞如肠道黏膜上皮细胞和活化的淋巴细胞等提供能源，也可在促进受损伤肠道的修复以及维持正常的局部免疫功能中发挥其他氨基酸不可替代的作用[23]。从肉仔鸡空肠分离出淋巴细胞，所得细胞悬液中加入Gln培养24 h，结果表明Gln可显著改善淋巴细胞增殖；当Gln浓度超过50 μg/mL后，其对肉仔鸡肠道淋巴细胞增殖的抑制效果最为显著，有利于维持免疫系统的平衡状态，且对丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性有显著的改善作用，有利于动物机体的抗氧化[24]。

4.2 精氨酸

4.3 SCFAs

SCFAs是含有2～5个碳原子的有机酸，主要由肠道中的细菌对寡糖、多糖、肽、蛋白质和糖蛋白的发酵作用所产生。SCFAs作为肠道菌群的主要代谢产物，在调节肠上皮细胞和肠道黏膜组织内各种免疫细胞上发挥一定的功能，同时参与固有免疫应答和适应性免疫应答，缓解炎症反应，抑制肿瘤细胞的增殖，维持肠道黏膜的稳态。SCFAs可通过影响肠上皮细胞和肠道黏膜组织内不同免疫细胞的功能，识别TLRs，活化G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)，抑制组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)活性等参与肠道疾病的发生发展[29]。大肠中的细菌发酵可产生SCFAs，其中SCFAs中的丁酸是肠道组织细胞首选的可氧化燃料[30]。研究表明，乙酸盐和丙酸盐可显著降低黏膜细胞旁通透性和跨上皮净流体通量，同时增加黏膜碳酸氢盐的分泌[31]。n-3和n-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)可减少γ-变形杆菌的过度增殖，同时促进生长拟杆菌属的增殖；n-3 PUFA比n-6 PUFA在改善小鼠失血性休克复苏(hemorrhagic shock resuscitation，HSR)后回肠组织溶菌酶活性上具有优势。PUFA特别是n-3 PUFA可部分改善HSR后小鼠肠道黏膜的先天性免疫[32]。醋酸盐可抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-3活性和B细胞淋巴瘤相关蛋白(Bcl-2 associated X protein，BAX)表达，有利于细胞存活，这可能与上调胃黏膜系统的关键防御因子黏蛋白(MUC)5AC有关。乙酸在乙醇诱导的胃损伤中有保护胃的作用，其通过协同的多径时延作用介导，包括抑制胃氧化、炎症和细胞凋亡以及促进MUC5AC表达[33]。随着肠调节性T细胞数量和肠腔IgA产生的增加，小肠上皮细胞中视网膜脱氢酶1(retinaldehyde dehydrogenase 1，RALDH1)表达量与肠系膜淋巴结DC中维生素A转换酶活性相关。膳食纤维的消耗可改变小肠中产SCFAs微生物的结构和SCFAs的组成[34]。虽然SCFAs有利于肠道黏膜免疫，但其在肠道菌群的构成和功能中发挥的具体作用与肠道菌群和肠道黏膜免疫相关疾病之间的关系，还需进一步深入研究。

4.4 核苷酸

核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸3种物质组成的化合物，具有多种重要的生物学功能，如合成遗传物质、传递细胞信号、参与能量代谢、作为辅酶等。核苷酸参与能量的转移，是核酸合成的前体[35]，参与体内一系列生理调节过程，具有促进生长和肠道发育、改善免疫机能等生理作用，是一种半必需营养物质[36]。饲粮中的核苷酸可通过核苷酸载体的调节作用促进健康动物肠道的正常发育，调节细胞增殖与凋亡的平衡，维持其正常水平的免疫机能。与补救合成相比，从头合成核苷酸需要消耗大量能量和底物。在快速生长、疾病、创伤或应激状态下，饲粮中补充核苷酸可促进免疫系统发育，维持肠道健康，节省能量[37]；也可通过核苷酸载体的调节作用保护肠道，促进其损伤后修复，并调节其免疫机能[38]。有研究表明，猪饲粮中补充核苷酸可显著降低饲料转化率，增加十二指肠绒毛高度、空肠乳糖酶和麦芽糖酶活性及外周血白细胞数，改善血清IgA和IL-1β含量以及回肠TLR-9、TLR-4和Toll样蛋白相互作用蛋白(toll-interacting protein，Tollip)的mRNA表达量，同时显著增加回肠紧密连接蛋白(Claudin-1和ZO-1)的mRNA表达量[39]。CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)可显著增加LPS刺激细胞中的IL-12、TNF-α和TLR-9的mRNA表达量，并增强核转录因子-κB(NF-κB)的信号活化[40]。此外，核苷酸也被广泛用作水产养殖中的免疫增强剂。在虾饲料中添加核苷酸，可显著降低对虾血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、iNOS和溶菌酶活性[41]。然而核苷酸对动物肠道(肠细胞、基因等)的作用机制，动物在不同发育阶段外源核苷酸的需要量、最大耐受量及其量效关系等问题均需深入研究。

4.5 益生菌

4.6 维生素

维生素A(vitamin A，VA)作为人体重要的微量营养素，除维持正常视觉外，还可促进人体生长发育、上皮组织增殖分化；可作为一种重要的免疫调节剂，在感染性疾病中发挥重要作用，其缺乏时可降低细胞免疫和体液免疫机能[51-52]。有报道指出，VA缺乏可显著降低鱼的生长性能，增加肠炎发病率，降低肠固有体液免疫反应并加重肠道炎症[53]。近端肠、中端肠和远端肠中的不同免疫反应部分由NF-κB标准信号传导途径和p38有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路介导。VA还可通过上调鱼类肠道、机体和鳃核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)/kelch样ECH相关蛋白1(kelch-like epichlorohydrin-associated protein1，Keap1)信号途径，上调铜锌超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)等抗氧化酶的基因表达并提高酶活力，提高非酶性抗氧化物质谷胱甘肽(GSH)和VA含量，提高自由基清除能力，降低活性氧(ROS)含量，从而降低氧化损伤；同时可能通过增强雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)信号途径下调caspase-8和caspase-9的mRNA表达量，从而下调caspase-3(而不通过caspase-7)的mRNA表达量，抑制肠道、机体和鳃细胞凋亡，维持鱼类肠道、机体、鳃细胞结构的完整性[54]。

维生素D(vitamin D，VD)是一种在紫外线辐射刺激下主要在人体皮肤中合成的激素。VD在调节钙、磷平衡中的作用已较为清楚，其能平衡钙、磷的吸收和储存，具有防治佝偻病的作用。除了在骨代谢中的内分泌作用外，VD还具有显著的免疫调节作用。VD对免疫系统的影响包括提高单核/巨噬细胞的杀微生物能力和缓减T淋巴细胞产生的炎性细胞因子的下调[55]。VD通过增强控制黏膜通透性和减少促炎性细胞因子(如IL-8)的细胞间连接，起到维持肠道黏膜屏障完整性的作用。此外，VD受体介导的信号转导已被证明可抑制炎症诱导的肠上皮细胞凋亡，维持足够的VD水平对健康肠道微生物群的发育是必不可少的[56]。VD可通过上调大鼠肠道上皮紧密连接蛋白的表达来抑制坏死性小肠结肠炎(NEC)的发生发展[57]。有研究表明，1,25-二羟维生素D3对肠道微生物群和基质成纤维细胞具有调节作用[58]，同时还具有抑制肿瘤、调节免疫、防治肥胖等功能[59-61]。

烟酸(vitamin B5)，也称尼克酸(nicotinic acid)，具有扩张末梢血管、保持皮肤和消化器官功能正常的作用，主要通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP)参与碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢，尤其在体内功能代谢反应中发挥重要功能。烟酸以辅酶形式参与鱼类体内200多种脱氢酶的反应，对鱼类消化器官的正常功能起重要作用。有研究指出，烟酸缺乏可降低草鱼肠道溶菌酶、酸性磷酸酶(ACP)活性及补体3(C3)含量，下调肝脏中抗菌肽2(LEAP-2)、肝细胞生长因子、IL-10、TGF-β1、κBα/IκBα抑制剂、TNF-α、IL-1β、IFN-γ2、IL-8、核因子κBP65、IκB激酶α(IKKα)、IκB激酶β(IKKβ)和IκB激酶γ(IKKγ)的mRNA表达量[62]。

4.7 矿物质

适量的矿物质对机体具有保护作用，过量时会对机体产生毒性，适当减少矿物质的添加量，可提高其在肠道中的吸收率，释放肝脏中富集的部分矿物质[63]。但当微量元素缺乏时，可导致动物生产性能下降，降低免疫应答[64]。硒(selenium，Se)可参与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)组成，参与体内抗氧化作用，对体内氢或脂形成的过氧化物有较强的还原作用，保护细胞膜结构完整和功能正常，具有保护心血管功能、增强免疫机能和削弱重金属毒性的作用[14]。张大为[65]研究指出，不同水平的Se和维生素E可提高免疫应激固始鸡的血清和肝脏抗氧化能力，显著降低过氧化物含量，显著改善机体的免疫应激状况，提高机体抗氧化能力，同时降低肠道NO含量和iNOS活性，对肠道起积极保护作用。锌(zinc，Zn)是脂类、碳水化合物、DNA、RNA以及蛋白质合成及分解的重要营养物质，Zn有抵抗疾病、促进伤口愈合和维持上皮完整性等重要作用。有研究表明，Zn可通过激活GPCR39上调蛋白激酶C ξ(protein kinase C ξ，PKC ξ)信号分子，促进紧密连接蛋白ZO-1和钙黏素的蛋白表达；此外，Zn还可通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR通路促进细胞分化和细胞间连接蛋白ZO-1的mRNA表达量，增强肠道屏障功能，从而改善Caco-2单层上皮细胞完整性[66]。

4.8 多糖和寡糖

多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，具有许多重要的生物活性，如参与细胞骨架的构成，也是多种内源性生物活性分子的组成成分。多糖作为一种免疫促进和调节剂，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等生物学活性[67-68]。有研究指出，从韩国的柿子醋中提取的粗多糖(KPV-0)对肠上皮Caco-2细胞没有细胞毒性，且在体外共培养系统中可以通过Caco-2细胞单层转运，同时显著增加PP细胞IgA的产生，并引发TGF-β1和IL-6含量的升高；体内口服结果表明，KPV-0可显著增加肠液和粪便中的IgA含量[69]。未发酵玉屏风多糖(UYP)和发酵玉屏风多糖(FYP)均显著促进断奶獭兔的生长和增强免疫活性，改善肠道菌群平衡，维持肠道屏障结构和功能的完整性；同时FYP可增加肠道菌群多样性和纤维素分解菌的丰度，减少链球菌和肠球菌属的丰度；在胃肠道中，特别是前端，FYP通过上调空肠和回肠中的紧密连接蛋白、聚合免疫球蛋白受体、三叶因子和表皮生长因子的mRNA表达量来维持肠道屏障的完整性和功能[70]。从黑根霉发酵液中提取的胞外多糖(EPS1-1)可以增强免疫抑制小鼠的免疫力，可抵抗人造胃中的水解；口服EPS1-1可调节肠道微生物菌群并且增加大肠癌小鼠粪便中的SCFAs含量，可增加结肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度及酸性黏液分泌杯状细胞的数量[71]。猴头菌多糖(HEP)可显著改善雏番鸭的肠道形态结构和相关指标，抑制呼肠孤病毒(MDRV)感染引起的肠道黏膜上皮淋巴细胞、杯状细胞和肥大细胞的降低，显著增加sIgA、IFN-γ和IL-4的分泌，增强肠道黏膜免疫功能[72]。

5 小 结

肠道黏膜免疫是机体防止感染的重要防线，同时也是宿主与外界环境间建立和维持稳态平衡的重要门户。随着科学研究的不断深入，采取靶向有效措施以期改善肠道黏膜免疫防御效果，加强肠道黏膜免疫屏障功能是营养学和免疫学等交叉领域的研究重点。目前，对参与肠道微生物调控的特定营养素和参与免疫调节的特定共生细菌，还需进一步深入研究来揭示肠道微生物免疫和营养调节在动物肠道中相互作用的潜在机制，以期更科学的为营养素和非营养素对动物肠道免疫机能及其免疫调节作用机制提供理论依据。