十字花科根肿病菌在水中存活能力检测分析

袁 远 ，曹 喆 ，杜 飞，何鹏飞，何月秋 ，吴毅歆

（1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201;2.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201）

由芸薹根肿病菌（Plasmoliophora brassicae Woronin）侵染所致的十字花科蔬菜根肿病是十字花科蔬菜的世界性病害之一。该病害导致十字花科蔬菜产量下降，甚至绝收，是一种常见且危害严重的真菌病害［1-5］。该病在我国境内十字花科作物上均有发生，发病面积约67万hm2，造成严重的经济损失，已经严重影响我国十字花科作物生产。该病的病原菌是一种土传性活体寄生菌，专性寄生于十字花科植物，不能进行人工培养，病菌从休眠孢子囊萌发产生游动孢子侵入根部，经10 d左右致根系形成肿瘤，游动孢子是该病传播的主要危害［7］。根肿病的发生受温度、湿度、土壤pH、光照、土壤含水量和病原菌数量的影响，带菌水传播也是根肿病迅速传播的主要原因之一［8］。对根肿菌生活史的研究国外比国内早，基本上大部分实验室都是在明确生活史的前提下通过双重培养技术和悬浮细胞培养技术来研究十字花科植物根肿病的发病全过程。在我国这方面的报告还很少，处于启蒙阶段［9］。国内外对根肿病的研究一直都很重视，通过不懈的努力在致病机理、病原菌生理小种鉴定、根肿菌防治、病原体离体技术等方面均取得了突破性进展［9-18］。目前对于休眠孢子的萌发环境及侵染能力之间互作关系的研究还不是太多。为了更好地防治根肿病的发生，对影响根肿病休眠孢子萌发的生物及非生物因子的研究十分必要［19-20］。本研究通过对不同温度水体根肿菌存活情况和水中微生物活动及各项水体指标的检测结果，为研究根肿病休眠孢子萌发的生物及非生物因子和环境及侵染能力之间的互作关系提供依据，为根肿病的田间防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试根肿病菌于2017年1月采自昆明市周边白菜种植大棚的病变白菜根肿组织。

1.2 根肿菌孢子检测方法

水体根肿菌孢子检测方法采用赵玮琦等［10］方法稍作修改检测，并建立荧光定量PCR标准曲线。

1.3 根肿菌的定量检测

使用0.22 μm滤膜抽滤样本水体富集水体微生物，抽滤20～150 mL水体样本，直至滤膜堵塞难以抽滤，记录所抽滤水体体积。将滤膜剪碎分装入2 mL离心管中，依据DNA Water Kit（OMEGA公司）的说明书提取DNA，用于荧光定量PCR检测。结果对照标准曲线计算DNA浓度，带入所抽滤水体体积，计算原水体根肿菌孢子浓度。

1.4 孢子悬浮液制备

取100 g白菜根肿组织与200 mL纯净水打碎成匀浆状，四层纱布过滤分装入50 mL离心管中，2 500 g/min 离心20 min，弃上清液，沉淀重悬于50 mL纯净水中，该步骤重复3～4次；加入5 mL 50%蔗糖溶液悬浮，2 500 g/min离心20 min；将上清液移入一新的离心管中加入45 mL纯净水，2 500 g/min离心20min，弃上清；沉淀溶于5 mL纯净水中，保存于4℃冰箱中。

1.5 不同水体温度根肿菌存活检测

试验设4个温度梯度16、19、22、25℃，将4个光照培养箱调节至上述4个温度，每个温度下放置3个模拟水体样品作为3个重复，另设一个2 L不含孢子的无菌蒸馏水样品作为空白对照。

使用血球计数板于显微镜下计算孢子悬浮液中孢子浓度。制备12个模拟水体样品，每个样品在一个塑料桶中加入1 990 mL纯净水，加入10 mL稀释后的孢子悬浮液，将样品的孢子浓度调节至1×106CFU/mL。使用0.1 mol/L HCl溶液将样品pH值调节至5.5；使用电导率仪检测测水体电导率，0.1 mol/L NaCl溶液将样品盐度调到统一值。定期提取各个样品的DNA用于荧光定量PCR检测计算样品水体，同时测量各处理的化学需氧量（COD）和溶解氧含量（DO）。

2 结果与分析

2.1 不同水体温度下的根肿菌孢子浓度

将模板 DNA 稀释为 1×107、1×106、1x105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝 /μL 7 个不同梯度用于进行荧光定量PCR。以模板DNA起始浓度的对数值（x）为横坐标，以Ct值（y）为纵坐标作荧光定量PCR标准曲线，如图1所示。标准曲线为y=-3.101x+34.594，扩增效率97%，R2=0.9995。从图2扩增曲线上可发现该对引物的精确度为10拷贝/μL，阴性对照信号出现在30～35个Ct值范围内，超过30个Ct的信号默认为是阴性信号，该信号由引物二聚体所产生。根据所得的熔解曲线（图 3）可知，在熔解温度 Tm=84.5℃出现单一峰形，未见其他峰值，说明扩增效率和熔解温度均一，扩增产物特异性好，以此为基础进行定量是可靠。

图1 根肿菌质粒DNA梯度稀释后绘制的标准曲线

图2 不同浓度梯度质粒标准品扩增曲线

图3 不同浓度梯度质粒溶解曲线

2.2 不同水体温度对根肿菌存活的影响

在4个水体温度梯度16、19、22、25℃，分别接种浓度为3×106CFU/mL根肿菌孢子。水温在16～25℃区间内，随着温度的提高，根肿菌孢子下降的速率变缓，在25℃时最为缓慢，处理30 d达1.88×106CFU/mL，并在处理60 d后相对稳定，说明根肿菌在25℃下较其他温度更容易存活（表1）。

表1 不同时期各处理孢子浓度

电导率与溶液中离子的含量成比例关系，可间接判断水中溶解物质的含量。从表2可见，随时间的延长，各处理电导率都呈缓慢增大。说明处理中根肿菌呈增长趋势。

表2 不同处理水体电导率变化情况（103μS/cm）

溶氧量是衡量生物在水中生存的重要指标。氧在水中的含量因有机物分解及生物呼吸把氧消耗掉而使水中溶氧量经常会改变。从表3可见，不同时期各温度处理的溶氧量随处理时间增长出现不规律的浮动，说明微生物活动频繁。

表3 不同处理水体溶氧量变化情况（mg/L）

COD作为衡量水中有机物质含量的指标，化学需氧量越大，说明水体中有机物的数量多。从表4可见，不同时期各处理的COD随时间增长呈现普遍上升的趋势，且不具有规律性。COD值越高说明水中根肿菌的数量越多。

表4 不同处理水体化学需氧量变化情况（mg/L）

3 结论与讨论

根肿病的发生受温度、湿度、土壤的pH值、光照、土壤含水量和土壤中病原菌数量的影响。根肿病发生的最主要条件是土壤中大量存在的根肿菌休眠孢子［21］。根肿菌休眠孢子可以通过很多途径进行传播。带菌水传播也是根肿病迅速传播的主要原因之一［8］。在根肿病发生区，不仅地块之间灌溉水漫灌和串灌现象普遍，而且种植户常在公共水源中清洗蔬菜，随意丢弃病株或将带病的蔬菜卖给养鱼户喂鱼，再用这些被污染了的池塘、水库中的水灌溉农田，从而加速了病菌扩散与蔓延，使病害发生面积逐年扩大。根肿病菌传播，且孢子量越多，感病率越高。研究作物根肿病的传播途径，对规模化育苗和灌溉水处理控制病害有重要意义。灌溉水携带病原传播植物病害是影响农作物产量的重要原因，水池育苗能加快病害的蔓延速度，尤其在可利用水较少、降雨量偏少、水分有限时，这种状况更为严重。灌溉水中含有根肿菌曾有报道［8，12］，但已有的研究并未能详细阐述灌溉水中所含根肿菌的数量与其致病性和病害传播流行之间的关系［17-18］。

本研究利用实验团队首创的水体中根肿菌孢子荧光定量 PCR 检测体系［10］，建立QPCR标准曲线来检测根肿菌的孢子数量，对不同温度水体根肿菌存活的情况进行检测，实验结果表明在16～25℃区间内，随着温度的提高，根肿菌孢子下降的速率变缓，在25℃时相对最为缓慢，这与过去的研究中认为根肿菌最适宜的发病温度在20～25℃区间内的结论相一致。试验中孢子浓度随着时间的推移可以下降到原浓度的1 000倍以下，但是通过对判断水体中生物活动的主要指标电导率、溶氧量及化学需氧量指标的检测可以发现在此期间水中的微生物数量呈上升趋势且活动十分的剧烈，这与孢子浓度随水温升高而增加的结果测定结果相吻合，说明随温度的增高孢子浓度不断增加，随着时间推移水体中孢子浓度降低但根肿病数量呈上升趋势且活动十分的剧烈。但是与田间环境可能存在较大的差异，这是否会对试验的结果造成影响还有待进一步的研究。除此之外，光照、pH、有机质含量等因素也会对根肿菌孢子的存活造成一定的影响，还需要更进一步的研究阐明这些因素与水体中根肿菌存活能力存在着怎样的联系。