自发性2型糖尿病db/db小鼠肝病理损伤特点

康佳丽，梁伟时，孟徐兵，张丹丹，高庆瑶，薛 宁，韩淑英，王建行，曹福源

(华北理工大学 1.临床医学院； 2.冀唐学院； 3.实验动物中心，河北 唐山 063200)

2型糖尿病可对肝造成慢性进行性损伤，其肝并发症已成为研究热度较高的一类糖尿病并发症[1]。但糖尿病肝病变机制、具体病理改变等方面的研究还不够完善，防治仍有欠缺。db/db小鼠具有早期血糖升高、肝肾病变、胰岛功能缺陷等特点[2]，本文主要将不同时期db/db小鼠的肝与同源db/m小鼠的进行比较，为进一步以db/db小鼠肝作为2型糖尿病肝损伤模型的实验研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级db/db小鼠，体重33～38 g，7～8周龄，雄性；SPF级db/m小鼠，体重18～22 g，7～8周龄，雄性，购自常州卡文斯实验动物有限公司[SCXK (苏) 2016-0010]，于华北理工大学动物实验中心SPF级屏障实验室[SYXK (冀) 2015 - 0038]进行饲养，饲喂SPF级实验动物饲料(常州卡文斯实验动物有限公司)，并按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。该实验已通过华北理工大学动物实验伦理审查(编号：2017062)。

1.2 主要试剂与仪器

丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Masson三色法染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；苏木精染色剂(南京奥多福尼生物科技有限公司)；伊红生物染色剂(上海展云化工有限公司)。罗氏血糖仪及试纸(德国罗氏诊断有限公司)；真彩病理图像分析系统(高腾科技有限公司)；高倍显微镜(日本奥林巴斯有限公司)；透射电镜(日本日立公司)。

1.3 实验方法

将购来的小鼠适应性饲养一周，剔除不合格小鼠，随机选取16只db/m小鼠作为对照组，16只db/db小鼠作为模型组，观察小鼠一般状态，饲养至32周龄。

1.3.1 体重及空腹血糖的测定

分别在实验开始第一周(小鼠8周龄)、小鼠16周龄、32周龄时检测体重，并在禁食8 h后尾静脉取血测血糖。

1.3.2 血液肝功指标以及肝指数测定

在小鼠16、32周龄时禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血，全自动生化分析仪测定血清ALT、AST活性。于小鼠16、32周龄时，将db/m和db/db小鼠各处死8只，并分离肝组织。肝指数(liver index，LI)=[肝重量(g)/体重(g)]×100%。

1.3.3 光镜下观察肝组织学结构

将称重后的肝迅速固定，常规石蜡包埋、切片、烤片，然后分别进行HE染色和Masson染色。所有染片在光镜下观察并拍片。

1.3.4 电镜下观察肝组织超微结构

小鼠肝组织切块，常规双重固定，梯度酒精脱水，100%酒精∶丙酮(1∶1)浸透，纯丙酮浸透，丙酮∶树脂(1∶1)混合液37℃温箱过夜，纯树脂(815/812混合液)浸透，Epon 812包埋，半薄切片甲苯胺蓝染色，超薄切片厚度为50 nm，经醋酸铀和柠檬酸铅电子染色后，电镜下观察并拍片。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 db/db小鼠体重及空腹血糖动态变化

如表1所示，饲养期间db/db小鼠体重一直高于db/m小鼠(P< 0.01)。db/db小鼠的空腹血糖从8周龄时开始，便显著高于db/m小鼠(P< 0.01)，而且一直保持较高的水平。随着饲养时间的延长，db/db小鼠的体重及空腹血糖也逐渐升高。

表1 db/db与db/m小鼠体重与空腹血糖±s，n=8)

注：与db/m小鼠比较，△△P< 0.01；与8周龄小鼠比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与16周龄小鼠比较，#P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△△P< 0.01. Compared with the 8-week-old mice,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,#P< 0.05.

表2 db/db与db/m小鼠血清ALT、AST活性±s，n=8，U/L)

注：与db/m小鼠比较，△P< 0.05，△△P< 0.01；与16周龄小鼠比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△P< 0.05,△△P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,*P< 0.05.

2.2 db/db小鼠血清ALT、AST活性的动态变化

如表2所示，16周龄时db/db小鼠血清ALT、AST活性均明显高于db/m小鼠(P< 0.01，P< 0.05)。32周龄时db/db小鼠血清ALT、AST活性均有降低，相较db/m小鼠差异无显著性(P> 0.05)，但与16周龄的db/db小鼠相比，血清ALT活性降低且差异有显著性(P< 0.05)。

2.3 db/db小鼠肝指数动态变化

如表3所示，db/db小鼠的肝指数(LI)在16和32周龄时均高于db/m小鼠(P< 0.01)，16周龄时升高更为显著，到32周龄时db/db小鼠的肝指数较16周龄时有所降低(P< 0.05)。

2.4 肝组织在光镜下观察到的组织学结构改变

HE染色(图1)：光镜下db/m小鼠(图A1、B1)16周龄和32周龄时均表现正常，肝板围绕着中央静脉规则排列，细胞边界清晰，胞质内含细胞核一个或两个；db/db小鼠16周龄时(图A2)肝组织中细胞排列紊乱，胞核消失，细胞坏死，炎症细胞浸润，可见大小不等的脂滴空泡，肝细胞体积增大，细胞核大小不一；32周龄时(图B2)脂滴空泡明显减少，炎细胞浸润明显，肝细胞大量坏死，肝板、肝血窦等结构已无法辨认。

Masson染色(图2)：db/m小鼠(图A1、B1)仅在中央静脉周围可见极少量的蓝染胶原纤维；db/db小鼠16周龄时(图A2)可见大量脂滴空泡，中央静脉周围和组织内均有少量蓝染的胶原纤维，纤维化程度较正常组严重；32周龄时(图B2)大量的胶原纤维分布于肝组织内，纤维化明显。

2.5 肝组织在电镜下观察到的超微结构改变

电镜(图3)：db/m小鼠(图A1、B1)肝细胞内细胞核边界明显、核仁清晰，胞浆中线粒体数量多且形状规则，可见内质网等结构；db/db小鼠胞质内线粒体、内质网等结构被破坏，16周龄时(图A2)胞浆中出现大量脂滴空泡；32周龄时(图B2)肝细胞正常结构几乎消失，肝组织内代之以大量的胶原纤维。

3 讨论

本实验动态观察了db/db小鼠肝功能及其组织病理形态结构的变化。结果表明，随着时间的推移，db/db小鼠体重、空腹血糖逐渐升高，并显著高于db/m小鼠；解剖见腹腔有大量脂肪蓄积，表明db/db小鼠糖脂代谢明显紊乱，这点与文献报道一致[3]；db/db小鼠16周龄时，血清ALT、AST水平均高于db/m小鼠(P< 0.05)；db/db小鼠32周龄时仍相对db/m小鼠较高，但差异无显著性，而与db/db小鼠16周龄时相比较，ALT活性降低且差异有显著性(P< 0.05)。ALT大多存在于肝细胞浆内，AST则多在肝细胞线粒体中，肝细胞坏死使ALT、AST进入血清[4-5]，血清中ALT与AST水平的升高提示肝具有明显病变。db/db小鼠的肝指数均高于对照组(P< 0.01)，而32周龄时db/db小鼠的肝指数小于16周龄(P< 0.05)，这可能是随着实验的进展db/db小鼠体重增加所致。肝的病理学观察发现，db/db小鼠在16周龄时的明显病变为脂肪病变，伴有小部分细胞坏死，炎细胞浸润等，与相关报道相符[6]，这提示我们在实验研究中获取糖尿病脂肪肝模型时，应在小鼠成长至16周龄左右时较为合适；而到32周龄时肝脂肪变性已不明显而代之以肝纤维化和肝硬化，此病理变化过程与糖尿病患者的肝损伤的发展过程基本一致。

表3 db/db与db/m小鼠的肝指数±s，n=8，%)

注：与db/m小鼠比较，△△P< 0.01；与16周龄小鼠比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the db/m mice,△△P< 0.01. Compared with the 16-week-old mice,*P< 0.05.

注：A1：16周龄db/m小鼠肝组织；A2：16周龄db/db小鼠肝组织；B1：32周龄db/m小鼠肝组织；B2：32周龄db/db小鼠肝组织。下图同。图1 肝组织在小鼠16周龄和32周龄时的HE染色光镜图片(× 400)Note. A1: Liver tissue of a 16-week-old db/m mouse; A2: Liver tissue of a 16-week-old db/db mouse; B1: Liver tissue of a 32-week-old db/m mouse; B2: Liver tissue of a 32-week-old db/db mouse. The same in the following figures. Figure 1 Representative images of liver tissue stained with hematoxylin and eosin in the mice at 16 and 32 weeks of age

图2 肝组织在小鼠16周龄和32周龄时的Masson染色光镜图片(× 200)Figure 2 Representative images of liver tissue stained with Masson’s trichrome staining in the mice at 16 and 32 weeks of age

图3 肝组织在小鼠16周龄和32周龄的电镜图片(× 6000)Figure 3 Representative transmission electron micrographs of liver tissue in the mice at 16 and 32 weeks of age

2型糖尿病与肝病变之间有着复杂的牵连，研究发现其引起的肝损伤以非酒精性脂肪性肝病最常见[7]。目前临床用于治疗糖尿病的药物如二甲双胍、磺脲类药物、TZDs、DPP-4等多禁用于肝功能不全的患者或会对一般患者的肝造成一定程度上的损伤[8]，这就限制了糖尿病降糖药物的应用。因此，观察糖尿病慢性肝损伤的病理特点和肝功能变化在研究糖尿病肝病的病程发生发展规律及降糖药物对肝损伤的治疗作用时具有非常重要的意义。

目前已发表文献中用db/db小鼠作2型糖尿病模型时，以它作自身对照、饲养至20周以上的相对较少，本实验通过对比db/db小鼠16周龄时和32周龄时的肝的病理变化特点，为db/db小鼠作为2型糖尿病肝损伤模型以及不同时期的肝损伤模型的选择提供了依据。