Xpert MTB/RIF检测技术在结核病诊断中的价值

周喜桃 张跃军 曾莉怡 龙云铸

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引发的全球性严重危害公共卫生问题的慢性传染病之一， 2018年WHO全球结核病报告中估算，2017年全球的结核病潜伏感染人群约为17亿，潜伏感染率为23%；全球新发结核病患者约1000万例，约50%的新发患者来自于印度(27.4%)、中国(8.9%)、印度尼西亚(8.4%)和菲律宾(5.8%)；中国耐药结核病患病例数位居世界第二，耐药结核病患者新发比例达7.1%，高于世界平均水平[1]。 我国第五次结核病流行病学抽样调查报告发现，93.1%的结核病患者首诊单位为综合医院及下级基层医疗机构[2]；但由于结核病患者的临床症状差别很大，在综合性医院因典型结核病临床表现就诊的患者越来越少，往往因不同症状或其他疾病就诊于相关科室、科别，增加了临床的诊治难度，也容易造成结核病的传播。而利用快速、可靠、特异度和敏感度高的检测方法是进行临床早期诊断、合理治疗、及时阻断传播的重要措施。2010年12月WHO正式推荐使用GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert法”)作为一种全新的结核病快速检测新方法用于结核病及利福平耐药的检测，得到了广泛认可[3]。本研究比较分析Xpert法、夹层杯液基集菌涂片抗酸染色镜检法(简称“夹层杯法”)和传统固体罗氏培养法(简称“固体培养法”)在肺内外标本检测中的结果，评价Xpert法在综合性医院早期诊断和治疗结核病中的应用价值。

资料和方法

一、研究资料

收集2016年6月至2017年8月入住湖南省株洲市中心医院各科室376例疑似结核病患者的各类标本，分别进行Xpert法、夹层杯法和固体培养法的检测，其中痰标本227份(60.37%)，肺泡灌洗液109份(28.99%)，脑脊液21份(5.59%)，胸腔积液15份(3.99%)，其他标本4份(1.06%，包括引流液、脓液、分泌物、尿液各1份)。376例疑似结核病患者中，男252例(67.02%)、女124例(32.98%)，年龄15～92岁，中位年龄为65岁；来自于感染内科患者213例(56.65%)，呼吸科121例(32.18%)，以及心血管内科、心胸外科、神经内科、神经外科、风湿免疫科、中西医结合科、代谢分泌科等其他科室患者共计42例(11.17%)。依照《临床诊疗指南：结核病分册》[4]，结合患者临床表现、影像学检查、实验室检查及最终治疗结果进行疑似结核病和临床确诊结核病的诊断。最终临床确诊结核病349例，非结核病27例。

二、仪器与试剂

夹层杯法液基抗酸杆菌检验试剂盒由湖南省天骑医学新技术有限公司生产和提供；分枝杆菌萋尔-尼尔逊(Ziehl-Neelson)涂片镜检染色液、中性罗氏培养基均由珠海贝索生物技术有限公司提供；Xpert MTB/RIF系统为美国Cepheid公司的产品，检测试剂盒由湖南省长沙中圣有限公司提供(原装进口)。

三、标本的采集及检测方法

1.标本采集：教授患者留取痰液标本方法(清晨患者先用清水漱口，深吸气然后用力呼出，从肺部深处咳出痰液)，采集患者深部晨痰，用一次性无菌杯收集送检(疑为肺结核患者连续3 d取痰标本进行夹层杯涂片镜检)；肺内灌洗液、脑脊液等其他标本用一次性无菌离心管或一次性无菌杯送检。

2.夹层杯法：(1)标本的处理：各类标本按照夹层杯法液基抗酸杆菌检验试剂盒的操作说明书进行涂片、染色和镜检，参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[5]进行。(2)抗酸染色结果的判断(抗酸杆菌染成红色、非抗酸杆菌及细胞等染成蓝色)：涂片结果根据镜检抗酸杆菌的数量多少[5]进行分级报告，连续采用100倍油镜观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌(AFB)者为阴性、发现AFB者为阳性。

3.固体培养法：(1)标本的处理：采用“中和离心法”处理后的各类标本，取0.1～0.3 ml混悬液同时接种于2支罗氏斜面培养基进行分枝杆菌培养，接种第3、7天时各观察1次菌落生长情况，此后每周观察1次直至8周，操作严格参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[5]进行。对培养生长出的可疑菌落进行抗酸染色，阳性者送湖南省结核病医院进行菌种鉴定和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。

4.Xpert法：(1)标本的处理和检测：痰标本按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF样品处理液中，在涡旋振荡器上振摇20 s，静置15 min；肺泡灌洗液及脑脊液、胸腔积液、脓液、分泌物、引流液等其他类型标本分别用无菌离心管离心半径10 cm，4000 r/min离心15 min。取沉淀物1～2 ml备用，然后取已备用沉淀物按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF样品处理液中，在涡旋振荡器上振摇20 s，静置15 min。将处理好的标本用无菌吸管吸取2 ml，缓慢加入Xpert MTB/RIF检测试剂盒中，放入仪器开始检测。2 h反应结束后，报告MTB检出情况和利福平耐药结果。(2)结果的判定：Xpert法检测结果依照仪器内探针的循环阈值(Ct值)判断，Ct值≤38时即为MTB阳性，并可进一步按照Ct值对MTB进行半定量：Ct值<16为高含量，Ct值16～22为中含量，Ct值22～28为低含量；Ct值>28为极低含量；Xpert法检测利福平耐药的基础在于MTB特异性分子信标早期Ct值和晚期Ct值之差(即ΔCT值)，ΔCt值>3.5时提示利福平耐药，ΔCt值≤3.5时对利福平敏感，只有在MTB阳性的情况下才能检测利福平耐药情况。如有试验结果显示为无法判断、无结果、无效或错误时，重新留取标本进行检测。

四、质量控制

各标本的前期处理均按《结核病实验室标准化操作与网络建设》[5]要求在生物安全柜内进行，无过度处理、标本污染现象存在。痰涂片镜检按照实验室标准化操作中操作和质量保证要求，实施了痰涂片盲法复检和室内质控。MTB培养所使用的罗氏培养基每批次均分别接种阳性质控菌株结核分枝杆菌标准减毒株H37Ra(ATCC25177)和阴性质控菌株大肠杆菌(ATCC25922)进行检测，合格后方可使用。Xpert MTB/RIF系统每个检测匣定期进行样品处理质量控制(SPC)和探针质量控制(PCC)，来确保样品经过正确处理和探针符合指定的接受标准，保证检测系统合格。

五、统计学处理

采用SPSS 19.0软件对资料进行数据处理，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3种检测方法的阳性检出情况及阳性率的比较

本研究对376例疑似结核病患者的不同类型标本同时采用Xpert法、夹层杯法和固体培养法进行检测：Xpert法检测阳性共141例，其中假阳性1例(Xpert法阳性、极低含菌量且利福平耐药、痰涂片和培养均为阴性；经临床确诊为肺癌后取痰标本重新检测为阴性，排除结核病)，其余140例经临床确诊均为结核病；夹层杯法检测阳性共86例，其中4例 Xpert法阴性并经临床诊断排除结核病，其余82例Xpert法均为阳性并经临床确诊为结核病；固体培养法检测阳性共67例，Xpert法均为阳性并均经临床确诊为结核病。

本研究中Xpert 法总体阳性率(37.50%，141/376)明显高于夹层杯法(22.87%，86/376)和固体培养法(17.82%，67/376)，差异均有统计学意义(χ2值分别为19.09、36.39，P值均<0.05)；夹层杯法总体阳性率与固体培养法比较，差异无统计学意义(χ2=2.96，P>0.05)。140例Xpert 法阳性且确诊为结核病的患者中，分别有136例肺结核患者和4例肺外结核患者。

336例疑似肺结核的标本中，Xpert法的阳性率(40.77%，137/336)分别高于夹层杯法(25.60%，86/336)和固体培养法(19.94%，67/336)，差异均有统计学意义(χ2值分别为17.46、34.49，P值均<0.05；夹层杯法与固体培养法比较，差异无统计学意义(χ2=3.06，P>0.05)；40例疑似肺外结核标本中Xpert法阳性率为10.00%(4/40)，夹层杯法和固体培养法均未检出，未进行统计学分析。详见表1。

二、3种检测方法检测MTB的效能评价

以结核病临床诊断为标准，Xpert法、夹层杯法、固体培养法检测的总体敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致性检验(Kappa检验)见表2。Xpert法检测敏感度[40.11%(140/349)]明显高于夹层杯法[23.50%(82/349)](χ2值=19.86，P<0.05)和固体培养法[19.20%(67/349)](χ2值=35.98，P<0.05)，Xpert法检测结果与临床诊断结果的一致性(K=0.080 )明显高于夹层杯法(K=0.016)与固体培养法(K=0.033)。

三、140例Xpert法检测阳性与不同级别含菌量患者与夹层杯法和固体培养法的比较

140例Xpert法检测阳性患者中，包含夹层杯法的82例和固体培养法阳性的63例；MTB含菌量级别比例从高到低依次为高含菌量8.57%(12/140)、中含菌量35.00%(49/140)、低含菌量32.14%(45/140)、极低含菌量24.29%(34/140)；其中4例肺外结核患者的MTB含菌量均为极低含量，夹层杯法和固体培养法均为阴性。详见表3。

表1 不同标本采用3种方法检测的阳性检出率比较

注其他标本指引流液、脓液、分泌物、尿液

表2 以临床确诊结果为标准3种检测方法检测MTB的效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

表3 Xpert法检出不同阳性含菌量级别在夹层杯法和固体培养法中的分布情况

140例Xpert法检测阳性患者中，极低、低含菌量级别患者共79例，高、中含菌量级别患者共61例。极低、低含菌量级别患者的夹层杯法检出率为32.91%(26/79)，明显低于高、中含菌量级别患者的检出率[91.80%(56/61)]，差异有统计学意义(χ2=49.20，P<0.05)；极低、低含菌量级别患者的固体培养法检出率为12.66%(10/79)，明显低于高、中含菌量级别患者的检出率[86.89%(53/61)]，差异有统计学意义(χ2=76.63，P<0.05)。

四、Xpert法检测利福平耐药结果

140例Xpert法检测MTB阳性患者中，耐利福平患者22例，耐药率为15.71%；同时有63例经固体培养法检出MTB，通过比例法药敏试验获得耐利福平MTB菌株9例，耐药率为14.29%，两种方法检测MTB对利福平的耐药率相近，差异无统计学意义(χ2=0.07，P>0.05)。且培养法中对利福平的耐药患者均与Xpert 法对利福平的耐药情况一致。

五、Xpert法阳性患者的临床科室分布情况

140例Xpert法检测阳性患者在明确诊断前，分布于院内各个临床科室。以感染内科(65.72%，92/140)和呼吸内科(25.71%，36/140)多见；其他分别为神经内科3例、心血管内科2例、中西医结合科2例、神经外科2例、心胸外科1例、风湿免疫科1例、代谢内分泌科1例，共计12例(8.57%)。

讨 论

目前，我国结核病的实验室诊断方法主要有涂片抗酸染色镜检、分枝杆菌培养和分子生物学等检测方法。涂片抗酸染色镜检法虽然操作简单、经济，但敏感度和特异度均较低，容易漏检；分枝杆菌培养法虽然是结核病诊断的“金标准”，但耗时长；普通的PCR技术容易发生交叉污染，假阳性率高，对结核病的诊断价值不高。当前实验室检测虽然可用夹层杯液基集菌涂片抗酸染色法替代直接涂片法和一些仪器微生物快速检测系统，一定程度上达到提高阳性率和缩短培养时间[6-7]的目的，但仍无法满足临床诊疗的需要，如何能早期、快速、准确地检测出各类临床标本中的MTB及其耐药性成为临床迫切的需要。

随着分子生物学技术的发展，由美国开发的一种新型Xpert MTB/RIF全自动检测系统解决了这一问题，能在2 h内从患者标本中直接检出是否含有MTB及该菌是否对利福平耐药[8-9]。本研究中，Xpert法检测的总阳性率(37.23%)和在各类标本中的阳性检出率均明显高于夹层杯法和固体培养法，差异均有统计学意义；尤其对于肺外标本，由于肺外标本中含菌量都非常低，夹层杯法和固体培养法检查均为阴性。本研究中疑似肺结核患者均连续采取痰标本3次(行支气管纤维镜患者同时取灌洗液)进行夹层杯法检测，且夹层杯法采用离心集菌后涂片，仅1次阳性即可判定该患者涂片阳性，而固体培养法只采取了1次标本进行培养，因此夹层杯法阳性率高于固体培养法，但差异无统计学意义。本研究以临床确诊结核病的诊断结果为标准，发现Xpert法检测MTB的敏感度及一致性均明显高于夹层杯法和固体培养法，与相关报道[10]结果相似。由此可见，Xpert法检测MTB在筛查结核病和临床应用价值方面优于夹层杯法和固体培养法，能更好地帮助早期诊断和治疗菌阴结核病。

Xpert法检测MTB的临床检出阈值低，据相关研究报道[11]，处理后的标本抗酸染色通常需5×103CFU/ml才能得到阳性结果，而Xpert法检测只需131 CFU/ml即可检出。Xpert法阳性的含菌量级别依次分为高、中、低和极低含量4个级别，本研究将Xpert法对不同菌量级的检测结果与夹层杯法和固体培养法的检测结果进行统计分析，发现140例Xpert法阳性标本中，高、中、低和极低含量分别占8.57%、35.00%、32.14%和24.29%，极低、低含菌量级别的比例高于高、中含菌量级别；其中12例“高”、49例“中”、45例“低”、34例“极低”级别标本中采用夹层杯法和固体培养法检出率分别为100.00%和100.00%、89.80%和83.67%、48.89%和22.22%、11.76%和0.00%，随着标本中含菌量级别的降低其夹层杯法和固体培养法检出率均依次降低。由此说明，Xpert法检测含菌量级别越低，夹层杯法和固体培养法越难检出，Xpert法可大大提高低含菌量标本的阳性率，且Xpert法阳性例数基本覆盖夹层杯法和固体培养法的检出结果。

随着耐药菌株的增多，耐多药结核病(MDR-TB)也逐渐增多，而大部分对利福平耐药的菌株也同时对异烟肼耐药，因此可以将利福平耐药性的检测作为MDR-TB的监测指标[12-13]。传统MTB药敏试验需要对菌株分离培养后进行，结果报告耗时长。从本研究可以看出，Xpert法可快速测定对利福平的耐药情况，140例Xpert法阳性标本中利福平耐药检出率为15.71%，与相关文献相近[14-18]；并与金标准“比例法”的耐药率(14.28%)差异无统计学意义，且培养法中对利福平的耐药患者均与Xpert 法对利福平的耐药情况一致，能为临床医生治疗方案的选择及时提供依据，对MTB的耐药性检测更具有优势。

目前，多重耐药菌株已经成为医院感染的重要病原菌。在综合性医院中，对一些常见多重耐药菌(如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌、耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌、多重耐药肠杆菌科细菌等)已开展了常规的监测，但对MTB及MDR-TB的监测开展尚不多见[19]。在综合性医院中，结核病患者由于临床表现不同，加之部分患者因基础性疾病就诊，往往就诊的科室不同，需在相关科室通过各项检查后才能初步诊断，给结核病的防控带来一定难度，能否快速诊断结核病成为一个敏感问题。从本研究可以看出，有34.28%的结核病患者是因为临床表现不典型和其他基础性疾病分布于各个科室，在明确诊断之前并未按结核病预防隔离要求严格采取措施；而结核病主要通过人际间传播，且MDR-TB患者治疗难度大、疗程长、痰菌阴转率低、持续排菌，使新感染者成为原始耐药者[20-22]，可造成严重的流行病学和公共卫生后患；使得如何及早诊断、掌握耐药情况和科室院内暴露情况，及时进行预防隔离对控制结核病的医院感染具有重要意义。

由此可见，Xpert法具有快速、简单、敏感度高，且生物安全要求不高，能同时检测利福平耐药情况等优点，并能提高低含菌量标本的检出率，可更好地辅助临床医生及早诊疗和及时预防隔离。因此，该技术在试验条件的低要求、可靠性、早诊疗、医院感染预防控制等方面都值得在综合性医院中推广，特别是实验室条件不成熟和标本量不多的基层医院更值得推广使用。