五味子对照提取物的纯化工艺研究

罗莉娅，邓星，苟立平，温倩雯，万丽*

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinese(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。习称“北五味子”，具有敛肺滋肾，生津敛汗，涩精止泻，宁心安神的功效[1]。五味子主要成分为木脂素类。五味子作为临床常用药和大多数保健品的重要原料，使用范围广泛，用量大。

中药对照提取物专属性较强，配制操作简单，价格低廉，既能用于薄层色谱法，对药材进行定性鉴别，也可以标示多个单体成分的含量，在定性鉴别中，可以达到与多个对照品同时鉴别相同的效果，中药对照提取物的研究已经成为中药标准物质研究的趋势[2,3]。因此本实验尝试考察薄层用五味子对照提取物的纯化工艺，同时对制得的五味子对照提取物的包装储藏进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 1200Series高效液相色谱仪（安捷伦公司)；DSY-1-2孔电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）；BP211D（十万分之一）型电子天平（德国Sartorius公司）；ZF-90型暗箱式紫外透射仪（上海顾村电光仪器厂）；UPT-Ⅱ-10T优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.2 材料

五味子药材购于成都荷花池中药材市场，经成都中医药大学药学院鉴定学标本馆卢先明教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinese(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实。依照《中国药典》2015年版一部五味子药材项下要求检查质量均合格。五味子醇甲对照品（批号:MUST-16021905，纯度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子酯甲对照品（批号:MUST-15082302，纯度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子酯乙对照品（批号:MUST-15111112，纯度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子甲素对照品（批号:MUST-16022401，纯度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子乙素对照品（批号:MUST-15112611，纯度≥98%（HPLC），成都曼斯特生物科技有限公司）；五味子对照药材（批号:120918-201110，中国食品药品检定研究所）；流动相为色谱甲醇，其他有机试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 五味子对照提取物纯化工艺考察[4]

本实验主要以五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素为指标，HPLC测定，采用单因素法对纯化过程中树脂型号、树脂用量、提取液浓度、洗脱剂浓度、洗脱剂用量等参数进行考察，并采用薄层色谱对参数进行验证。

2.1.1 色谱条件 色谱柱：phenomenexluna 5μ C18100A 250*4.60 mm；流动相A为甲醇，流动相B为水，按下表1中的比例进行梯度洗脱；检测波长250 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。

表1 HPLC梯度洗脱条件

2.1.2 混合对照品溶液的制备 对照品溶液的配制：分别称取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素适量，用甲醇定容成1 mg·mL-1，作为对照品储备液。分别精密吸取五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素对照品储备液各2 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。HPCL测定，结果如图1。

图1 五味子混合对照品HPLC图

2.1.3 大孔吸附树脂的预处理 取大孔吸附树脂适量，95%乙醇浸泡24 h，装柱。采用95%乙醇洗脱至乙醇:水（1:5）不变浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味，抽滤至不滴水为准，备用[4]。

2.1.4 五味子提取液的的制备[5]取五味子药材粗粉100 g，置于2000 mL圆底烧瓶中，精密加入10倍量浓度为95%的乙醇。加热回流两次，每次1 h，摇匀，纱布滤过，合并两次滤液，抽滤后减压回收乙醇，用蒸馏水定容至1000 mL，即得（生药浓度0.1 g·mL-1）。

2.1.5 大孔树脂型号考察 取预处理后的D101、HPD100、HPD400、A8-8，4种树脂各7 g，置150mL锥形瓶，平行2份，精密加入50 mL浓度为0.1g·mL-1（含药材5 g）的五味子提取液，时时振摇，放置24 h后，过滤，取续滤液15 mL，用甲醇定容至20 mL， HPLC测定滤液浓度，计算每种树脂吸附量。用等量蒸馏水冲洗大孔树脂，除去水溶性多糖、无机盐离子等杂质，最后将抽滤后的树脂转移到另1个具塞磨口三角瓶中，加入100 mL浓度为95%的乙醇密封静置，时时振摇，放置24 h以静态洗脱树脂，过滤大孔树脂，滤液置于蒸发皿中蒸干，残留物用甲醇定容至100 mL，进行HPLC检测。测定解吸液浓度，计算每种树脂的解吸率[6]，结果见表2。

表2 不同型号树脂的吸附量和解吸率

总吸附量(mg)=(吸附前溶液浓度-吸附后溶液浓度)×溶液体积

吸附量(mg·g-1)=(吸附前溶液浓度-吸附后溶液浓度)×溶液体积/干树脂质量

解吸率(%)=(洗脱液的平衡浓度×洗脱液体积)/总吸附量× 100%

结果表明，型号为AB-8的树脂吸附率和解析率都较高，能较好地吸附五味子当中的木脂素成分，所以选择AB-8的大孔树脂吸附五味子提取液。

2.1.6大孔树脂用量的考察[7]分别称取4 g、5 g、6g、7 g、8 g型号为AB-8的大孔树脂置于锥形瓶中，分别加入浓度为0.1 g·mL-1的提取液50 mL，振摇后静置24 h。将已吸附24 h不同量的树脂，抽滤，取续滤液15 mL，用甲醇定容至20 mL，微孔滤膜过滤，滤液HPLC检测，结果见表3。

表3 不同树脂用量3种成分的吸附量

结果表明，当用7 g型号为AB-8的树脂吸附50 mL浓度为0.1 g·mL-1的提取液时，在树脂用量较少的情况下保持吸附率和解析率较高，为节约成本，树脂用量为7 g。

2.1.7 提取液浓度的考察 分别量取4份50 mL五味子提取液于锥形瓶中，分别加蒸馏水稀释至1、1.25、1.5、2倍，再分别加入A8-8大孔树脂各7 g，封口，振摇后静置24 h。分别抽滤并取续滤液，按2.1.6.1项下方法测定，结果见表4。

表4 不同提取液浓度3种成分的吸附量

结果表明，当五味子提取液不稀释时，即提取液浓度为0.1 g药材/mL，吸附率和解析率较高，且蒸馏水用量较少。故提取液的最佳浓度为0.1 g药材/mL。

2.1.8 洗脱剂浓度的考察 分别称取3份AB-8的树脂各7 g，分别加入50 mL浓度为0.1 g·mL-1的五味子提取液，静置并时时震摇24 h后滤过，蒸馏水洗涤，抽滤后的树脂分别加入50 mL浓度为75%、85%、95%的乙醇，振摇后静置24 h过滤，滤液置于蒸发皿中蒸干，残留物用甲醇定容至100 mL，微孔滤膜滤过，滤液用HPLC检测。结果见表5。

表5 不同洗脱剂浓度3种成分的解吸率

结果表明，使用95%乙醇，解吸率最高，故选择95%浓度乙醇作为洗脱剂。

2.1.9 洗脱剂用量的考察 称取5份AB-8树脂各7 g，分别加入50 mL浓度为0.1 g·mL-1的提取液，振摇后静置24 h，抽滤，抽滤后的树脂分别加入50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL95%的乙醇振摇后并静置，24 h后过滤，后按2.1.6.3项下方法测定，结果见表6。

表6 不同洗脱剂用量3种成分的解吸率

结果表明，70 mL乙醇能较好地把五味子中的木脂素成分洗脱下来，为避免浪费，故洗脱剂的最佳用量为70 mL。

2.2 验证性实验

根据上述实验结果得到的最佳纯化参数，制备得到五味子提取物用95%乙醇溶解得到每mL含1 g五味子药材的五味子对照提取物溶液，与对照品溶液、对照药材溶液，各取2 µL点于同一硅胶GF254的薄层板上，以石油醚（30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm )下检视，结果如图2。

图2 五味子对照药材薄层色谱图

2.3 五味子对照提取物包装

五味子对照提取物主要成分为木脂素类成分，如五味子醇甲，五味子甲素，五味子乙素，较难干燥，且含有较多的糖分，干燥后为黄色油状液体，不容易分装，因为粘稠度较大，容易吸潮，不易干燥，也不易长期保存。综上所述，考虑直接用适当溶剂溶解油状对照提取物，再分装成一次取用量使用。

安瓿瓶密封性好，防止吸潮，使用方便，故选择安瓿瓶封装保存。通过查阅文献可知，五味子对照提取物常用的溶剂有甲醇、乙醇、三氯甲烷，三种溶剂溶解对照提取物点样效果相同。而乙醇毒性最小，溶解度较大，挥发性较小，且本身具有杀菌作用，适用于长期保存，故选择乙醇作为五味子对照提取物的溶剂。

浓度考察实验结果表明，1 g药材/mL浓度的对照提取物溶液取2 μL时的斑点与对照药材2 μL效果相同，故最佳浓度为1 g药材/mL，这时达到了等量同质的效果。

3 稳定性试验

取制得的五味子对照提取物用乙醇溶解为浓度1 g药材/mL的溶液，将溶液取最小分装量1 mL封装于1 mL容量的棕色安瓿瓶内，进行影响因素试验，测定高温稳定性和光照稳定性。实验结果表明其性质稳定，易于保存。

4 讨论

本实验对五味子对照提取物的纯化条件和包装工艺进行研究，得到了最佳工艺参数，并在后期考察了五味子对照提取物的稳定性，对五味子对照提取物的研究奠定了一定的试验基础。五味子对照提取物制备方法较为简单，可适用于工业生产。制得的五味子对照提取物的薄层色谱斑点清晰，分离度好，与1g五味子对照药材等量同质，使用简单，易于储藏，可用于五味子的药材定性鉴别。