MLN4924对家蚕BmN细胞增殖及基因表达的影响

钱 平,罗 影,刘茹婷,唐旭东

(江苏科技大学 生物技术学院,镇江 212018)

蛋白质翻译后修饰是细胞内许多蛋白质发挥正常生物学功能的重要调节机制．其中,基团类修饰的机制主要有甲基化、糖基化、磷酸化和乙酰化等;小分子修饰蛋白质有泛素、类泛素(SUMO,NEDD8,ISG15,ATG8/12)等．修饰的底物蛋白涉及细胞内生命活动的各个方面,如细胞凋亡、转录因子活性调节、蛋白质转运、蛋白质降解和DNA损伤修复等[1]．神经前体细胞表达发育下调蛋白8(neuralprecursor cell expressed developmentally downregulated protein 8,NEDD8)是一种类泛素蛋白,它与底物蛋白的共价修饰过程称为Neddylation[2],其发生过程与泛素化类似,都需要E1(NEDD8 E1 activating enzyme,NAE)、E2(UBC12和UBE2F)、E3(RING domain subunits RING-box protein 1,RBX1等)系列酶介导催化反应并且这是一个可逆的过程[3-5]．研究者在肺腺癌、鳞状细胞癌等肿瘤细胞中都发现了Neddylation相关蛋白的过量表达[6-7],由此抑制Neddylation途径成了抗肿瘤的一种策略．2009年，文献[8]通过筛选药物库首次发现了Neddylation特异性的抑制剂MLN4924,MNL4924与NAE酶的竞争性结合阻断它与E2的结合,从而阻断了NEDD8与底物蛋白的结合，不仅能诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡和自噬,还可以抑制肿瘤的血管发生细胞迁移[9-12]．MLN4924对肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌等都具有治疗效果,目前作为唯一的Neddylation抑制抗肿瘤药物，已经进入一期临床实验[9，13-15]．同时有研究发现MLN4924对许多病毒都具有抑制作用,如艾滋病病毒(HIV)、裂谷热病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、流感病毒等…[16-19]．因此，MLN4924具有成为抗肿瘤和抗病毒药物的潜在价值．前期研究发现，MLN4924对家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclear polyhedrosis virus,BmNPV)具有显著的抑制效果.为了阐明其作用机理,文中从MLN4924对病毒宿主产生的影响角度开展研究,评估了MLN4924对家蚕BmN细胞的影响,旨在为MLN4924在家蚕研究领域的应用提供理论依据．

1 实验

1.1 实验材料

家蚕BmN细胞系由本研究室培养与保存,细胞培养条件为27 ℃,含有10% FBS、50 μg/mL氨苄青霉素和100 μg/mL链霉素的TC-100培养基，Applichem公司[20]；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，碧云天生物技术有限公司；MLN4924，MCE公司；RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒，北京博凌科为生物科技有限公司；PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒，SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒，TaKaRa公司(大连宝生物)．

1.2 细胞毒性测定

分别用1,5,10 μmol/L的MLN4924处理家蚕BmN细胞，二甲基亚矾(DMSO)处理组作为对照,持续处理时间点为24、48和72 h,随后加入MTT溶液,继续培养4 h后加入Formanzan溶解液,最后用酶标仪在570 nm处测定吸光度．

1.3 细胞凋亡测定

用10 μmol/L的MLN4924处理家蚕BmN细胞,DMSO处理组作为对照,24 h后用PBS洗涤贴壁细胞3次,随后依次加入195 μL Annexin V-FITC结合液,5 μL Annexin V-FITC,10 μL碘化丙啶(PI)染色液,混匀后室温孵育20 min,共聚焦显微镜拍照后统计视野中死亡细胞与正常细胞的比率,每个样本统计3个视野．

1.4 MLN4924胁迫表达谱分析

用10 μmol/L的MLN4924处理家蚕BmN细胞,DMSO处理组作为对照,24 h后用试剂盒提取总RNA,委托华大基因公司完成测序工作,具体实验和数据分析方法参照文献[21]．

1.5 qRT-PCR

MLN4924细胞处理方式与1.4节一致,RNA提取、反转录和定量PCR(qRT-PCR)按照各说明书进行．选择的差异蛋白基因分别为BGIBMGA000942、BGIBMGA007432、BGIBMGA008161、BGIBMGA013776、BGIBMGA005849、BGIBMGA012729、BGIBMGA007466,以GADPH为内参基因,引物序列见表1．

表1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

qRT-PCR反应在ABI7300荧光定量PCR仪上进行,应用ABI 7300 SDS software V2.0(applied biosystems)软件分析每个反应的值,并计算相对表达量,用SPSS16.0(statistical program for social sciences 16.0)分析表达差异．

2 结果与分析

2.1 MLN4924对BmN的细胞毒性

用不同浓度的MLN4924处理BmN细胞24、48、72 h后,用MTT法检测MLN4924对BmN细胞的毒性,结果如图1.从图中可看出，各个样品在570 nm处的吸光值没有显著差异,表明实验浓度的MLN4924对BmN细胞没有细胞毒性．

图1 MLN4924对BmN细胞的毒性Fig.1 Celltoxicity of MLN4924 on BmN cells

2.2 MLN4924对细胞凋亡的影响

为了检测MLN4924是否会引起BmN细胞凋亡,用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测用10 μmol/L MLN4924(M10)处理BmN细胞24 h

后的细胞凋亡情况.Annexin V-FITC可以透过坏死细胞的不完整细胞膜使细胞质呈现绿色荧光,PI可以透过染色坏死细胞或凋亡晚期细胞的不完整细胞膜使细胞核呈现红色荧光,如图2(图中PI为碘化丙啶,死细胞核指示剂荧光图;Light为白光下细胞形态图;Overlay为荧光、细胞核指示剂和白光合并图).由图可看出，处理组和DMSO对照组都有一些细胞发生了凋亡；此外也统计了凋亡细胞和正常细胞的比率,结果表明MLN4924处理组和DMSO对照组凋亡细胞没有明显差异．

图2 MLN4924对BmN细胞的细胞凋亡影响Fig.2 Apoptosis of BmN cells treated with NLN4924

2.3 MLN4924对家蚕细胞基因表达的影响

2.3.1 测序质量分析

本研究所用测序样品处理组(M10)和对照组(DMSO)分别获得13 126 739和13 126 712条Raw Reads,经过滤分别获得12 875 504和12 917 892条Clean Reads,占比分别为98.08%和98.40%,各样品Q20和Q30值都大于最小值,说明测序结果比较稳定(表2)．

表2 RNA-seq数据统计Table 2 Overview of RNA-seq data

测序饱和度分析的目的是检验检测到的基因数目是否随着测序量的增加而增加,分析结果表明，当测序量达到60 M以上时,检测到的目的基因数目逐渐趋于饱和(图3),而本研究中两组样品的测序量都达到120 M以上,能够达到对检测的目的基因的完全覆盖．

图3 测序饱和度曲线Fig.3 Curve of sequencing saturation

这说明实验获得的数据质量良好,可用于进一步的数据分析．

2.3.2 差异表达基因分析

家蚕数据库中家蚕总基因14 623个，样品中M10处理组和DMSO对照组分别检测到10 972个和10 956个,占参考基因的75.03%和74.92%．在两个样品中都检测到基因有10 265个,按照处理与对照基因表达水平超过2倍即认为是差异表达基因的标准,有136个基因定义为差异表达基因,其中76个基因表达上调,60个基因表达下调(图4)．

图4 差异表达基因统计分析Fig.4 Statistical analysis of DGEs

2.3.3 差异表达基因的功能

通过GO(gene ontology)基因功能分类系统对差异基因进行注释,发现其涉及31个GO分类条目, 15个条目属于生物学过程,其中涉及细胞内过程、代谢过程和单细胞过程的基因数目较多,分别为23,25和15个基因;10个条目属于细胞内组分,其中涉及细胞、细胞组分和细胞器组分的基因较多,分别为11、11和7个基因;6个条目属于分子功能,其中涉及结合和催化活性的基因最多,分别有22和27个基因与此相关(图5)．

图5 差异表达基因的GO功能注释Fig.5 GO functional classification of differential expressed genes

在KEGG(kyoto encyclopedia of gene genomes)数据库中对差异表达基因可能涉及的信号通路进行分析,以P值小于0.05作为富集标准,获得的136个差异基因中有87个可以富集到15个信号通路中,其中脂肪消化和吸收、溶酶体、胰腺分泌途径有较多的基因富集(表3)．

表3 差异基因KEGG通路分析Table 3 KEGG pathway of DGEs

2.3.4 差异表达基因的qRT-PCR验证

为了验证高通量测序的有效性,随机选择7个基因对其表达量进行qRT-PCR检测(图6),所得结果与表达谱分析结果基本一致,虽然一些基因的表达差异倍数有一定差异,但基本的变化趋势相同,这说明基因表达谱获得的结果是可靠的．

图6 差异表达基因的qRT-PCR验证Fig.6 Validation of DGEs withqRT-PCR

3 结论

本研究中研究了MLN4924对家蚕BmN细胞的毒性和细胞凋亡的影响．通过查阅文献,在所有肿瘤细胞中有效抑制浓度均未超过10 μmol/L,因此选择MLN4924的浓度为1～10 μmol/L．结果表明，在1～10 μmol/L的MLN4924胁迫下,与对照组相比,处理组BmN细胞未发现显著的细胞凋亡诱导,说明家蚕BmN细胞对MLN4924有较高的耐受性,该结果为以后在家蚕细胞中使用MNL4924提供了可靠的使用剂量标准．

目前已知的MNL4924抗肿瘤的机制主要为阻断Cullin-RING泛素连接酶体中Cullin蛋白的Neddylation修饰,诱导Cullin-RING泛素连接酶底物的聚集,引起肿瘤细胞的DNA损伤、细胞周期劫持、凋亡或衰老[9; 22],但这不是MNL4924对肿瘤细胞产生作用的唯一途径, Neddylation修饰的底物蛋白除了Cullin之外还有其他蛋白,如抗肿瘤蛋白P53,也是一个被Neddylation修饰的蛋白,MLN4924能够通过RPL11/RPL5-Mdm2途径激活P53的转录活性,从而达到抑制肿瘤的效果[23]．同时也有一些转录因子，如E2F1、TRIM40等， 会因为Neddylation修饰而形成转录活性的抑制,另外一些信号转导途径如mTOR、JNK、AKT、NF-κB等也受MLN4924处理的影响[10，24-26]．由此可见,MNL4924作为Neddylation抑制剂在蛋白翻译后修饰和基因转录水平都影响了细胞的生理活动．本研究通过数字基因表达谱技术研究了MNL4924对家蚕细胞基因转录的影响,对所获得结果综合分析发现,虽然所使用浓度的MLN4924没有引起家蚕BmN细胞的明显细胞病变,但确实对细胞的基因转录产生了影响,实验中一共发现136个差异表达的基因,其中76个基因转录上调,60个基因转录下调．GO和KEGG分析结果显示这些基因参与了细胞的许多生物学进程,如脂肪消化和吸收、溶酶体、类固醇代谢等．

前期实验研究了家蚕NEDD8蛋白的基因序列、表达模式、细胞内定位等信息[27],也发现MLN4924对BmNPV病毒DNA复制、多角体形成、出芽型病毒粒子形成具有显著的抑制效果．将MLN4924表达谱数据与BmNPV感染表达谱数据交叉比对[28]发现，若干受BmNPV诱导表达的基因在MLN4924处理后出现了表达下调的情况,推测其可能与BmNPV复制有关,但其具体机理还需要进一步研究．