利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a

汪 伟， 孙春娃， 杨爱文， 金 皓， 姚 萍， 袁维维， 徐建明， 周玉珍

(淮阴师范学院/江苏省环洪泽湖生态农业技术重点实验室，江苏淮安 223300)

木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源。近年来，各地露天大面积直接焚烧秸秆的现象时有发生，并且日趋严重。而秸秆焚烧不但造成严重的资源浪费，而且会排放大量的污染物，使得局部大气和水环境质量恶化，造成环境污染[1]。在矿物燃料资源日趋枯竭、环境日趋恶化的严峻形势下，利用廉价的木质纤维素生产液体燃料和大宗化学品，可以有效地缓解能源和环境危机，促进全球经济的可持续发展[2-3]。

纤维素酶是实现秸秆等废弃木质纤维素水解为单糖，继而发酵生产生物乙醇和其他化工产品的生产过程中最为关键的环节之一[4]。生物产纤维素酶的效率很低、生产成本高、酶活性低、用量大等因素限制了纤维素酶的推广和应用[5]。丝状真菌是自然界中降解木质纤维素的主要微生物，其中木霉属中的里氏木霉是最重要的代表菌株[6]。里氏木霉分泌的纤维素酶具有产量高、种类相对齐全等特点，也是工业生产纤维素酶的主要菌株[7]。里氏木霉的纤维素降解酶的表达合成受到多级控制，然而大部分调节发生在转录水平。不同纤维素酶的编码基因被共同调节，这意味着它们同时受到诱导或抑制，虽然诱导或抑制的程度不尽相同[8-10]。其中外切酶CBHⅠ(cellobiohydrolase Ⅰ)占里氏木霉分泌的纤维素酶组分的60%，其次为CBHⅡ(cellobiohydrolase Ⅱ)和EG2。而β-葡萄糖苷酶在里氏木霉分泌的纤维素酶组分中含量最少，其酶活性较低，因此造成水解体系中纤维二糖的积累，由此可见，人为过量表达β-葡萄糖苷酶是提高纤维素酶整体酶活性的有效途径之一。

有研究显示，在细胞膜上1个通透酶负责将纤维二糖运送到细胞内，从而诱导纤维素酶的合成[11]。然而，关于纤维二糖是否就是纤维素酶的诱导分子还不是很清楚。纤维二糖的诱导效果不如其位置异构体，如槐糖、龙胆二糖和昆布二糖，其中槐糖的诱导效果最好[12-13]。有研究者在用β-葡萄糖苷酶作用过的纤维素酶降解纤维素的溶液中分离得到纤维二糖的异构体，主要有槐糖，说明β-葡萄糖苷酶对纤维二糖不仅有水解作用，很可能还在纤维素酶诱导分子的合成过程中起到重要作用[14]。

相关研究还显示，β-葡萄糖苷酶Cel1a有转糖基作用的酶活性，可以催化纤维二糖得到槐糖、纤维三糖、纤维四糖等[14]。敲除里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a、cel3a或cel1b后，严重延迟了纤维素酶的表达时间，使得胞外纤维素酶的活性也有所降低(cel1a受到的影响最严重)，而添加强诱导物槐糖后又恢复了纤维素酶的正常表达[11，15-16]，说明β-葡萄糖苷酶在里氏木霉纤维素酶诱导物槐糖的形成过程中起着重要作用。1个不影响β-葡萄糖苷酶Cel1a的转糖基作用的酶活性而降低了其水解酶活性的单个氨基酸的突变(V409F)提高了纤维二糖对里氏木霉纤维素酶的诱导作用[17]，进一步说明β-葡萄糖苷酶的转糖基作用在纤维素酶的诱导合成过程中起到重要作用，因此，体内过量表达β-葡萄糖苷酶不但能提高里氏木霉体内纤维素酶的整体酶活性，更能研究其纤维素酶的诱导表达机制。本研究利用重叠PCR成功克隆β-葡萄糖苷酶cel1a，并使其受里氏木霉看家基因β-actin的启动子(Pact)启动，能够在里氏木霉细胞内持续过量表达，以期为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及试剂

大肠杆菌(EscherichiacoliDH5α)、二元载体pCAMBIA1300、里氏木霉Rut C-30均为笔者所在课题组保存。大肠杆菌(EscherichiacoliDH5α)感受态细胞由笔者所在实验室制备。DNA回收试剂盒、TaqDNA聚合酶、PCR DNA纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒、Pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶、RNase、dNTP、DNA marker、限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ，均购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。其他试剂均为进口或国产分析纯。PCR引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成，DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 引物设计

根据GenBank上里氏木霉基因组DNA中看家基因(β-actin)的启动子(Pact)DNA序列和β-葡萄糖苷酶cel1a基因序列，设计PCR程序，分别扩增Pact(长度约为1 200 bp)和cel1a(长度约为2 200 bp)DNA片段XbaⅠ-Pact-F和Pact-cel1a-R、Pact-cel1a-F和cel1a-HindⅢ-R，考虑到后续要利用重叠PCR拼接2个基因片段为Pact-cel1a(长度约为3 400 bp)及其后续的克隆酶切位点，在扩增Pact的上游引物上添加XbaⅠ酶切位点 5′-TCTAGA-3′(用波浪线标出)，在下游引物上添加cel1a的5′端DNA序列(用下划线标出)；在扩增cel1a的上游引物上添加Pact的3′端DNA序列(用下划线标出)，在下游引物上添加HindⅢ酶切位点5′-AAGCTT-3′(用波浪线标出)。引物序列如下(加粗的为2个引物的重叠部分)：

XbaⅠ-Pact-F：5′-TATATATATCTAGACACAGCA-GAAGGGGGTTCCGTCAAC-3′ ；

Pact-cel1a-R：5′-GGGCAGCATTGTGACTGA-TTAATGTATGAAGCTGATGAAAG-3′；

Pact-cel1a-F：5′-ATTAATCAGTCACAATGCT-GCCCAAGGACTTTCAGTGG-3′；

cel1a-HindⅢ-R：5′- ATTATATATAAGCTTGCCATC-ATGGTGCTGCTGTTTCTG-3′。

1.3 启动子Pact与cel1a的PCR扩增与纯化

用冮洁等的方法提取里氏木霉Rut C-30基因组DNA[18]，经DNA琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop检查纯度及其浓度后，以里氏木霉RutC-30基因组为模版，根据Pfu DNA 聚合酶说明书要求，用第1.2节中设计的引物分别扩增启动子Pact和cel1aDNA片段。其PCR扩增程序均如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 36 s，70 ℃，30 s，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃冷却后进行琼脂糖凝胶电泳检测。由于PCR产物较纯，采用PCR纯化试剂盒分别纯化Pact、cel1aDNA片段。

1.4 重叠PCR连接Pact与cel1a

以第1.3节PCR扩增并纯化的Pact和cel1a为DNA模板，按照Pfu DNA聚合酶说明书要求，以XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R为引物拼接Pact、cel1aDNA片段，并扩增Pact-cel1a。其PCR扩增程序均如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 36 s，70 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃冷却后进行琼脂糖凝胶电泳检测。由于出现多条PCR产物，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大小合适的PCR产物。

1.5 融合DNA片段Pact-cel1a的克隆

由于引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R上分别设计有XbaⅠ、HindⅢ酶切位点，Pact-cel1a的两端分别含有XbaⅠ、HindⅢ酶切位点。因此可以通过XbaⅠ、HindⅢ双酶切把Pact-cel1aDNA片段克隆到二元载体pCAMBIA1300上。根据说明书要求选择Tango buffer对Pact-cel1a和二元载体pCAMBIA1300分别进行XbaⅠ、HindⅢ双酶切。分别纯化Pact-cel1a、pCAMBIA1300双酶切片段，按照T4连接酶试剂盒说明书，将酶切后的Pact-cel1a和pCAMBIA1300片段连接起来，得到重组质粒Pact-cel1a-pCAMBIA1300，并用化学转化法将连接产物转化到大肠杆菌(EscherichiacoliDH5α)感受态细胞中进行重组子的筛选、鉴定。从阳性克隆子中提取重组质粒进行酶切和PCR鉴定，然后将所得阳性克隆委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 启动子Pact与cel1a的PCR扩增

以里氏木霉RutC-30基因组为模版，分别以XbaⅠ-Pact-F和Pact-cel1a-R、Pact-cel1a-F和cel1a-HindⅢ-R为引物PCR扩增Pact、cel1a。取4 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由图1-a、图1-b可以看出，PCR获得了大小约为1 200 bp的Pact DNA片段和约为2 100 bp的cel1aDNA片段，与预期片段大小符合，表明PCR成功。由于PCR产物较为单一，采用PCR纯化试剂盒分别纯化Pact、cel1aDNA 片段，所得DNA浓度分别为12.5、11.5 ng/μL。

2.2 重叠PCR连接Pact与cel1a

2.2.1 重叠PCR的原理 重叠PCR的原理如图2所示。以里氏木霉Rut C-30基因组DNA为模板，分别扩增Pact、cel1aDNA片段，由于本研究采用具有互补末端的引物cel1a-Act-F、cel1a-Act-R，使得Pact的3′端和cel1aDNA的5′端DNA序列相同，在PCR过程中，Pact和cel1aDNA片段可以互为模板，并将Pact和cel1aDNA片段拼接在一起，得到Pact-cel1a，如果用两端引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R进行扩增，将得到Pact-cel1aDNA片段。

2.2.2 Pact-cel1aPCR扩增 以Pact、cel1a为模板，以XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R为引物，能将Pact、cel1a2个DNA片段连接起来，并扩增得到Pact-cel1a。由图1-c可以看出，cel1a大小约2 100 bp，启动子Pact大小为1 200 bp，拼接在一起约为3 400 bp。由图1-c还可以看出，PCR产物的主要条带在3 400 bp左右，说明拼接成功。由于PCR产物不单一，通过切胶回收得到Pact-cel1a的DNA浓度约为13.5 ng/μL。

2.3 Pact-cel1a的克隆

由于扩增Pact-cel1a时所用引物XbaⅠ-Pact-F、cel1a-HindⅢ-R分别含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位点，使得Pact-cel1a两端分别含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位点。因此可以通过XbaⅠ、HindⅢ双酶切而连接到二元载体pCAMBIA1300上。Pact-cel1a、pCAMBIA1300经XbaⅠ、Hind Ⅲ双酶切、纯化后，利用T4连接酶将2个DNA片段连接在一起，并将连接反应产物转化到大肠杆菌DH5α中。筛选阳性转化子进行PCR及质粒酶切鉴定。由图3可以看出，上面的条带为pCAMBIA1300的质粒片段，大小约为9 kb，下面的条带为Pact-cel1a片段，大小约为3.4 kb，因此可见载体和插入DNA片段与预期结果一致。重组质粒测序结果也与GenBank中的序列完全一致，进一步说明本研究成功用重叠PCR将启动子Pact与cel1a连接起来，并克隆到了pCAMBIA1300二元载体上，得到重组质粒Pact-cel1a-pCAMBIA1300。

3 讨论

重叠PCR 技术是采用具有互补末端的引物，分别扩增2个DNA片段，使得 PCR产物的引物互补部分形成重叠链，并在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段拼接起来[19]。因此，通过精心设计引物，可以将任意2个基因拼接连接形成2个目的基因的融合基因，中间无需任何目的基因的DNA序列，从而避免了依靠限制性内切酶进行基因重组的麻烦，也避免了连接序列中可能出现的非目的基因的DNA序列[20]。

本研究成功利用重叠PCR技术将里氏木霉看家基因(β-actin)的启动子(Pact)DNA序列与里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a的DNA序列拼接在一起，使得cel1a基因在里氏木霉内能由看家基因(β-actin)的启动子(Pact)驱动，能够在里氏木霉细胞内持续过量表达，从而增加了β-葡萄糖苷酶cel1a的表达量，有望提高纤维素酶的整体酶活性，今后也可以进一步研究与证实β-葡萄糖苷酶cel1a在里氏木霉纤维素酶表达调控中的作用。本克隆方法的建立为后续研究其他β-葡萄糖苷酶在里氏木霉纤维素酶表达调控中的作用，以及利用强弱不同的启动子控制β-葡萄糖苷酶在里氏木霉中的表达水平及其细胞定位奠定了技术基础。