不同酶液组合对椪柑原生质体分离的影响

周一鹏， 何 丽， 罗 丽， 许晓玲， 徐小勇

(扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009)

原生质体指采用酶解法或机械法去掉细胞壁的裸露活细胞，在一定条件下可以发育成完整的植株，同时，原生质体也是一种理想的单细胞系统[1]。因此，原生质体可以为现代生物技术研究的诸多方面提供有利的试验材料，已被广泛地应用于植物基础理论研究和遗传改良中[2-3]。然而，原生质体技术应用的首要前提是分离出高质量的原生质体。由目前的研究现状可知，影响原生质体分离的因素主要有分离起始材料、预处理、酶液组合和浓度、酶解时间、渗透压等。其中，酶液组合是影响原生质体分离成败的关键因素之一[4-5]。

目前，人们广泛使用的酶液组合为纤维素酶+离析酶或纤维素酶+果胶酶，已被成功地用于小麦、马铃薯、油菜、柑橘等植物的原生质体分离[6]。另外，值得注意的是，不同来源的纤维素酶对原生质体分离也有影响。研究发现，相对于非纯化的纤维素酶，纯化的纤维素酶用于烟草和葡萄原生质体分离时，可降低活性氧水平，提高分离效果[7-8]。柑橘原生质体主要由愈伤组织和叶片分离而来，所使用的酶液组合皆为纤维素酶R-10+离析酶R-10，然而纤维素酶R-10是一种非纯化的纤维素酶。本研究拟采用纯化的纤维素酶Worthington+离析酶R-10的酶液组合与常规酶液组合进行椪柑原生质体的分离，比较它们在原生质体酶解时间、产量及活性氧含量上的差异，从而分析纤维素酶纯化与否对椪柑原生质体分离的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将椪柑(CitrusreticulataBlanco)胚性愈伤组织保存于MT基本培养基中，每20 d继代1次；将愈伤组织用悬浮培养基(MT+0.5 mg/L ME+1.5 mg/L谷胺酰氨+50 g/L蔗糖)悬浮培养4代后用于原生质体的分离。

取新鲜椪柑果实，去掉果肉，将种子用水冲洗干净，用 1 mol/L NaOH浸泡10min，去掉果胶，转入超净工作台内，用无菌蒸馏水冲洗后，再用75%乙醇浸泡10 min，然后用1% NaClO溶液消毒20 min，再然后用无菌蒸馏水冲洗3次，每次5 min。最后用灭过菌的手术刀片剥去内外种皮，接种到MT培养基上，大约过30～40 d，待叶片充分展开后用于原生质体分离。

1.2 主要试剂

主要试剂有蔗糖、甘露醇、琼脂粉、吗啉乙磺酸(MES)、纤维素酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、纤维素酶(Worthington Biochemical Corporation)、离析酶(R-10 Onozuka，Yakult Honsha，Tokyo)、麦芽提取物、NaH2PO4、CaC12·2H2O、CPW13(含13%甘露醇的细胞-原生质体清洗液)、CPW26(含26%蔗糖的细胞-原生质体清洗液)、活性氧检测试剂盒。

1.3 试验方法

1.3.1 椪柑原生质体的分离 原生质体的分离参照何丽等的方法[9-10]，稍作修改。

愈伤组织原生质体的分离。取3 g愈伤组织于培养皿中，加入2 mL 0.7 mol/L EME培养基(MT+0.7 mol/L蔗 糖+0.5 g/L ME)中，再加入2 mL酶液(含2%纤维素酶R-10或纤维素酶Worthington+2%离析酶R-10+12.8%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值为5.8)。将培养皿用封口膜封口，于28 ℃暗条件下酶解24 h，酶解过程中每隔一段时间观察原生质体的分离情况，以确定最佳酶解时间。

叶肉原生质体的分离。取出试管苗的叶片，置于铺有滤纸的无菌培养皿中，用手术刀片将叶片切成1～2 mm宽的条状，之后放入预先加了2 mL左右0.6 mol/L EME(配方为 MT+0.6 mol/L蔗糖+0.5 g/L ME)的培养基中，最后加入 2 mL 酶液(含2%纤维素酶R-10或纤维素酶Worthington+2%离析酶R-10+10.9%甘露醇+0.011% NaH2PO4+0.12% MES+0.36% CaC12·2H2O，pH值为5.8)。将培养皿用封口膜封口，于28 ℃黑暗条件下酶解24 h，其间每隔一段时间观察原生质体分离情况。

将酶解完成后的原生质体(酶解混合物)通过孔径为 45 μm 的不锈钢筛网过滤，并用CPW13冲洗，之后将滤液转移到10 mL离心管中，于950 r/min离心10 min，去上清。将原生质体沉淀与2 mL CPW13混匀，之后用吸管轻轻转移到预先加入6 mL CPW26的离心管中，于930 r/min离心2 min，经CPW13/CPW26界面梯度离心纯化后，用吸管将2个液面间的原生质体带吸出。将纯化后的原生质体悬浮于电融合液(含12.7%甘露醇+0.03% CaC12)中备用。

1.3.2 椪柑原生质体产量的测定 采用血球计数板进行原生质体产量的测定。先将盖玻片盖在计数室上，将原生质体悬浮液滴在盖玻片一侧边缘，使其沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，直到充满计数室为止。依次逐个计数中央大方格内25个中方格里的原生质体数，然后根据下式计算原生质体产量：

1 mL悬浮液中的原生质体数=1个大方格悬浮液中的原生质体数×104；

原生质体产量(个/g)=原生质体密度(个/mL)×原生质体悬浮液的总体积(mL)/叶片质量(g)。

1.3.3 椪柑原生质体中活性氧含量的测定 采用活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定原生质体中的活性氧含量。按照1 ∶1 000的比例，用原生质体培养液稀释2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，使其终浓度为10 μmol/L。将原生质体收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，使原生质体浓度为106～107mL，于37 ℃水浴锅内孵育 20 min，每隔3～5 min颠倒混匀1次，使探针和原生质体充分接触。之后，用原生质体培养液将处理好的原生质体洗涤3次，以充分除去未进入原生质体内的DCFH-DA。最后设置1个对照管，按照体积比1 ∶1 000的比例加入阳性对照Rosup，并设置1个未加DCFH-DA的阴性对照。做好前处理后，于 30 min 内上样，用FACSAria流式细胞仪进行检测。

1.3.4 数据分析 试验重复3次，采用Excel 2003计算平均值和标准偏差，采用SPSS进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同酶液组合对原生质体酶解时间的影响

对于不同的酶液组合或酶解材料，其酶解时间一般也不同，因此在酶解过程中要进行持续观察，当观察到原生质体数量不再增多时，可停止酶解，开始后续试验，该阶段时间可视为适宜的酶解时间。本研究首先观察了酶液组合Ⅰ(纤维素酶R-10+离析酶R-10)和酶液组合Ⅱ(纤维素酶Worthington+离析酶R-10)对2种外植体酶解时间的影响。结果表明，对于愈伤组织或叶片，2种酶液组合所需的酶解时间均存在差异(图1)。总体而言，酶液组合Ⅰ所需的酶解时间较长，分别为18 h(愈伤组织)、20 h(叶片)；酶液组合Ⅱ所需的酶解时间则分别为6 h(愈伤组织)、16 h(叶片)。上述结果表明，采用纯化纤维素酶的酶液组合可以缩短酶解时间，从而提高原生质体的分离效率。

2.2 不同酶液组合对椪柑原生质体产量的影响

原生质体产量是衡量原生质体分离效果的重要指标。因此，本研究测定了2种酶液组合条件下原生质体的产量。如图2所示，酶液组合Ⅱ所获得的原生质体产量均比酶液组合Ⅰ高，且差异显著。酶液组合Ⅱ处理的愈伤组织原生质体的产量为酶液组合Ⅰ的9.09倍，酶液组合Ⅱ处理的叶肉原生质体产量为酶液组合Ⅰ的5.29倍。由此可见，酶液组合Ⅱ能较大地提高原生质体产量，从而为后续的原生质体操作，如细胞融合、转化或分子生物学研究提供了量的保证。

2.3 不同酶液组合对椪柑原生质体活性氧水平的影响

水稻、油菜、烟草和葡萄等植物的原生质体在分离过程中会产生活性氧[7，11-13]，而过多的活性氧积累会影响原生质体的再生。此外有研究表明，纤维素酶的纯度会影响原生质体的活性氧水平[7]。因此，本研究采用活性氧检测试剂盒测定了2种酶液组合条件下刚分离时原生质体的活性氧水平。结果发现，酶液组合Ⅰ中的愈伤组织原生质体的活性氧水平是酶液组合Ⅱ的1.96倍，且差异显著；对于叶肉原生质体，2种酶液组合间差异不显著(图3)。

3 结论与讨论

植物原生质体的分离涉及到细胞壁的去除，而这个过程需要借助一些酶制剂来完成。常用的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、离析酶、果胶酶等。其中，纤维素酶可以降解细胞壁的主要成分纤维素，其纯度和活力的高低直接影响原生质体的分离效果。本研究比较了酶液组合Ⅰ(纤维素酶 R-10+离析酶R-10)和酶液组合Ⅱ(纤维素酶Worthington+离析酶R-10)对椪柑原生质体分离的影响。结果表明，酶液组合Ⅱ在原生质体酶解时间和产量方面均明显优于酶液组合Ⅰ。因此可见，酶液组合Ⅱ更适合椪柑原生质体的分离。

对于这2种酶液组合在分离原生质体上的差异，可能有以下2个原因：一是酶液组合中的2种纤维素酶在酶活性上存在差异。纤维素酶R-10又称1，4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，来源于绿色木霉，含有降解天然纤维素的活性，1 mg酶制剂含有10 U酶活性单位；纤维素酶Worthington来源于里氏木霉，具有外切、内切葡聚糖酶活性，能够有效水解纤维素，1 mg酶制剂含有140 U酶活性单位。在同等浓度的条件下，纤维素酶Worthington降解细胞壁纤维素的速度更快，所需的酶解时间也就越短。二是2种纤维素酶在纯度上存在差异。纤维素酶Worthington是通过色析法纯化而来的，在纯度上远高于纤维素酶R-10。已有研究表明，非纯化的酶在原生质体酶解时易引起细胞损伤，而纯化的纤维素酶能减少活性氧含量，有助于原生质体的分离[7，11]，本研究也得到相似的研究结果。总体可以看出，纯化的纤维素酶Worthington可高效地分离椪柑原生质体，对于其他植物原生质体的分离具有重要的参考价值。