食源性单增李斯特菌14种潜在毒力基因的检测

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近年来， 随着食品生产、销售、环境和人们消费习惯 等方面的变化， 食品安全的新威胁不断涌现。食品流通过程中的微生物污染如果得不到良好的控制， 会对食品安全和人体健康造成严重威胁。食源性疾病主要由食源性微生物污染引起，是危害人类健康和社会 经济发展的重要公共卫生问题[1-2]。

单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes， LM)是一种胞内寄生的革兰氏阳性菌，重要的食源性人兽共患病原菌之一[3]，可引起人和多种动物的胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等[4]。该菌是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一且分布范围极广，环境耐受性较强。大多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为(2～15)/100万人，死亡率为20% ～30%[5-6]，近年来因食品污染本菌而引起的食物中毒病例频繁发生，使李斯特菌病作为一种重要的食源性传染病在世界范围内对食品安全及人类健康造成极大的危害[7]。20世纪90年代，WHO将单增李斯特菌列为食品4大病原菌之一[8]。

LM含有众多毒力基因，这些基因在感染机体和适应环境的过程中发挥着重要作用。2016年Maury对104株不同来源的代表性LM菌株进行全基因组序列分析，挖掘出15个LM高毒力分离株具备而参考菌株不具备的假定毒力因子基因/基因簇[9]。本试验以54株食源性LM分离株为对象，检测其中14个潜在毒力基因的分布，为LM致病性和食品LM的溯源奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株54株LM菌株分离自2014-2017年新疆生产建设兵团8个师，常规送检的冷冻鱼糜制品、调理肉制品，生禽肉等1 027份食品中(表1)。

表1 菌株来源及潜在毒力基因携带率Tab.1 Source of strain and carrying rate of potential virulence genes

1.2主要试剂 PCR Mix、琼脂糖、ddH2O、DL2000 DNA Marker均购自广州东盛生物科技有限公司。脑心浸液培养基(BHI)购自青岛高科技园海博生物技术有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。

1.3引物的设计与合成 根据Maury等研究[9]提供的网址(http://www.ebi.ac.uk/)，获得14个潜在毒力基因的序列，利用primer5.0自行设计引物(表2)，北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表2 14个潜在毒力基因引物序列及片段大小Tab.2 Primer sequence and the product length of potential virulence genes

1.4细菌DNA提取 将54株菌株分别从-80 ℃取出，摇菌复苏。按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，备用。

1.514种潜在毒力基因的PCR检测 PCR扩增体系:模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR mix 10 μL，然后加ddH2O至体积20 μL。95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每次检测均设有相同体系的LM hly基因阳性对照和ddH2O空白对照。

1.6PCR扩增产物的检测 PCR产物，DL2000Marker分别置于2%琼脂糖凝胶中，120V，50A电泳25 min，凝胶成像仪下观察。

2 结 果

2.154株LM食品源分离株潜在毒力基因携带情况 以54株食源性LM的DNA为模板，采用特异性引物对14种潜在毒力基因进行扩增，结果表明：不同食品种类来源的LM分离株均可检测到不同的潜在毒力基因，其中5563分离株携带8个潜在毒力基因，携带率57.14%；2935、716、804、807、723、6072大、6008小，这7个分离株携带7个潜在毒力基因，携带率50%；935、938、15BW340、931、461、873、713、708、796、928、 872、573、763、19BS444、571、914、5573、6072小、4788、5567，这20个分离株携带6个潜在毒力基因，携带率42.86%；921、925、926、5570、 577、472、5470、2941、3251、2947、3189、802、5474、3195、802、2956、3101-1、14BW340大、13BW339，这19个分离株携带5个潜在毒力基因携带率35.71%；791、 502、 4786、3197、 502-2、 22N992这6个分离株携带4个潜在毒力基因，携带率28.58%；21L662分离株携带3个潜在毒力基因，携带率21.43%(表2)。

2014—2017年，在1 027件11大类食品中共检出LM 54株，总检出率为 5.25%，54株食源性LM中，54%来源于调理肉制品和生禽肉(图1)。

图1 54株食品源LM来源比率 Fig.1 Rate of source in 54 foodborne LM strains

2.214个潜在毒力基因检出情况 14个潜在毒力基因的检出率各有不同，除芳香族氨基酸合成因子，EsaC蛋白类似物，差向异构酶/脱水酶家族蛋白和转录调控因子未检出外，检出率最高的是寡肽转运蛋白基因98.15%(53/54)，检出率最低的是Ⅱ型限制酶修饰系统Sau3 Al和磷酸葡萄糖转移酶系统基因9.26%(5/54)。其余毒力因子基因的检测率分别是：内化素样蛋白基因81.48%(44/54)、细胞壁表面锚定家族蛋白基因77.78%(42/54)、单价阳离子/H+逆向转运蛋白基因64.81%(35/54)、肽聚糖结合蛋白基因59.26%(32/54)、组氨酸代谢系统基因53.70%(29/54)、合成致死KAR3样蛋白基因51.85%(28/54)、精氨酸/鸟氨酸逆向转运蛋白基因35.19%(19/54)、ABC转运蛋白基因12.96%(7/54)(图2)。

图2 14个潜在毒力基因检出率Fig.2 Detection rate of 14 potential virulence genes

3 讨 论

目前，由LM,引起的食物中毒越来越多，自1926年首次分离到该病病原后，李斯特菌病现已呈世界性分布。近年来因食品污染该菌引起的食物中毒病例频繁发生，使李斯特菌病成为一种重要的食源性传染病，在世界范围内对食品安全和人类健康造成极大的危害[7]。随着世界贸易的发展、饮食方式的变化以及李斯特菌病对人类生产生活影响的不断加深，20世纪90年代，WHO将单增李斯特菌列为食品中4大病原菌之一[8]。

目前OIE手册规定认为所有LM分离株都具有相同的毒力，对公众健康的威胁同样严重；并且认为LM主要危害孕妇、老人、新生儿及免疫低下的人群[10]。但是越来越多的研究表明LM的型别与致病性和毒力有一定的关联，谱系1或血清型4b的LM毒力高于谱系2或1/2b，1/2a，1/2c。CC4，CC1，CC2，CC6克隆群的菌株不仅危害孕妇、老人、新生儿及免疫低下的人群而且危害健康人群，而属于CC9，CC121克隆群的菌株则只能危害前者[11-15]。

本研究发现14个潜在毒力基因的检出率明显不同，寡肽转运蛋白检出率高达98.15%，但未检测到EsaC蛋白类似物，芳香族氨基酸合成因子，差向异构酶/脱水酶家族蛋白和转录调控因子这3种潜在毒力基因。54株LM携带3～8个不同的潜在毒力基因，其中携带5～6个潜在毒力基因的菌株所占比例高达72.2%，携带率高的菌株是否有更强的致病性。 这些基于泛基因组分析挖掘的潜在毒力基因是否与毒力密切相关，是否能与InlA等核心毒力基因形成强毒力菌株的诊断标识还有待于更多试验数据的支持， 但是54株食品源LM均携带潜在毒力基因的现况应当引起关注。

2016年Maury对104株不同来源的代表性LM菌株进行全基因组序列分析，并结合菌株分离来源，临床信息等，挖掘出15个高毒力分离株具备而参考菌株不具备的假定毒力基因/基因簇[9]，并对其中的LIPI-4即磷酸葡萄糖转移酶系统(PTS)进行了初步研究，发现携带LIPI-4基因簇的LM09-00558口服和静脉注射进入小鼠后，在脑中的载菌量高于参考株EGDe，但其他组织的载菌量没有差异；LIPI-4基因缺失株在小鼠脑、母体胎盘和胎儿的载菌量极显著低于亲本株，但在血液中的载菌量没有差异。由于LIPI-4是CC4克隆群独有的，而CC4克隆群分离株中71.4%来自患病临床，因此作者认为LIPI-4是LMCC4克隆群高毒力的缘由[9]。

本试验对54株食源性LM检测发现仅有461、873、928、5573、2947这5株菌中含有PTS基因，且461、873、928、5573菌株携带的潜在毒力基因相同，2947少携带一个基因(细胞壁表面锚定家族蛋白)，但丁剑等发现接种2947，461菌株的小鼠6天内小鼠死亡率100%；而接种5573菌株的小鼠死亡率66.7%，因此推测LM毒力是多种毒力基因综合作用决定的[16]。

对新疆生产建设兵团食品中LM检测结果显示，食品中存在一定程度的污染，54株食源性LM中，53.7%来源于调理肉制品和生禽肉，对食品安全造成了主要威胁。连凯等人发现华东地区生肉及冷冻和冷鲜食品是LM 主要污染源[17]，而本研究中54株LM的主要来源与华东地区LM食品污染主要来源不同，这说明食源性LM的流行具有地域性，与地区饮食状况及生活习惯有关，因此分析食源性LM的主要来源 对于李斯特菌病的预防控制具有重要公共卫生意义。