乌苏图病毒及其人畜动物感染的研究进展

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乌苏图病毒(Usustu virus，USUV)属于黄病毒科黄病毒属[1],是一种虫媒病毒，主要宿主是鸟类，由蚊子进行传播。该病毒于1959年在南非斯威士兰乌苏图河附近的蚊子中被发现，因此被命名为乌苏图病毒。1964年，将携带病毒的库蚊处理后接种新生小鼠大脑中首次分离到病毒[2-3]。1981年，USUV首次在中非一个出现发热和皮疹症状病人分离出来。2004年，Nikolay 等人在一名布基纳法索(非洲国家)男孩身上分离到USUV[4]。2009年，意大利报道在一名病人证实感染了USUV[5]，这是在欧洲发现的首例人感染USUV病例。1996年，意大利的佛罗伦萨和皮斯托亚两个城市发现不明死因的鸟类，死亡鸟类中以乌鸫(Turdusmerula)为主要，意大利的兽医杂志进行了报道[6]，但没有得到广泛的关注。直到2001年，对保存的组织样品进行溯源检测后证实是USUV[7]，这也是USUV通过鸟类传入欧洲的最早证据之一。USUV病是地方流行性传染病，发现于非洲大陆，目前主要在欧洲传播流行，由于其为人兽共患病，从公共卫生防控方面应考虑应引起一定的重视。本文尝试对USUV的病原、宿主范围、临床症状、诊断及防控作一详细介绍。

1 病毒的基因特性

根据基因序列分析，USU基因序列非常保守，目前有6个谱系，3个非洲谱系和3个欧洲谱系[7]。已有数据和文献表明，非洲谱系基因的演变形成较复杂，欧洲谱系的主要在欧洲本土的易感动物和宿主之间循环传播形成[7]。

2 宿主范围

2.1蚊子 与黄病毒属其它病毒一样，蚊子是USUV传播的中间宿主。1959年，南非最早报道在成年的雌性库蚊中分离出USUV[2]。接着在非洲大陆的中非、布基纳法索、尼日利亚和乌干达等国家的也相继报道从蚊子分检测USUV[4]，近来，在肯尼亚也报道发现蚊子携带USUV[8]。从发现USUV传入欧洲后，欧洲各国对蚊子感染USUV水平的监测也相继展开。2006年，西班牙加泰罗尼亚地区通过监测在尖音库蚊(Culexpipiens)发现USUV[9]；2009年，在西班牙中部地区监测中发现(Culexperexiguus)携带USUV[10]。同年，意大利在国内不同地区普查西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)和USUV时，在库蚊(pipiens)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)中发现USUV[11]。2010年，德国通过监测在库蚊中发现USUV[12]，同年，捷克通过监测发现凶小库蚊(Culexmodestus)携带USUV[13]。随着大家对USUV关注度的增加，以色列在2014-2015年监测中，在尖音库蚊(Culexpipiens)、(Culexperexigus)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)检测出USUV[14]。通过分析携带USUV蚊子的种类发现，尖音库蚊(Culexpipiens)在各国监测中阳性率高[15]，为携带USUV的主要蚊子种类。

2.2鸟类 目前发现鸟类是USUV最主要宿主，USUV从非洲发现到目前主要在欧洲流行，可能的传染源也指向鸟类，携带USUV的候鸟定期迁徙从而将病毒扩散。USUV最早起源于非洲，在2001年以前，没有文献记载非洲在鸟类中发现USUV。直到2008年，摩洛哥在鸟类血清调查中检出USUV抗体[16]。2015年，突尼斯在鸟类血清学普查中发现棕斑鸠(Spilopeliasenegalensis)血液有USUV抗体[17]。近两年未见报道非洲地区鸟类感染USUSV的文献。

USUV目前在欧洲已成为鸟类的一种本土流行病。2001年，奥地利大量死亡的本地鸟类中分离出USUV[18]，这也是欧洲首次发现USUV，也是在非洲大陆外首次发现USUV。尽管后来，怀疑1996年意大利的佛罗伦萨和皮斯托亚两个城市发现乌鸫为主要不明死因的鸟类感染USUV致死，并在保存的样品检测出USUV得到证实[6]。并且推论早在1996年以前USUV已经传入欧洲。从这以来，欧洲大陆各国陆续在鸟类中发现USUV。

2001年和2002年，英国在普查USUV时，在乌鸦、喜鹊和火鸡血清中发现病毒中和抗体[19]，2004年对鸡群的血清学普查时同样发现USUV抗体[20]。

2003年至2006年之间，对奥地利和匈牙利52种322只死亡鸟只进行USUV感染情况调查，2003年和2004年的死亡鸟只没有发现USUV，2005年只发现1只死亡的乌鸫核酸及免疫组化检测都呈阳性[21-22]。监测结果可推测乌鸫经过病毒感染自身已有一定的抵抗力。

2002年至2005年，德国对87种侯岛和本土鸟类共3 399份血清样本监测WNV和USUV抗体，发现1只白鹳(Ciconiaciconia)、1只红尾鸲(Phoenicurusphoenicurus)和1只鹗(Pandionhaliaetus)血清USUV抗体呈阳性[23]。

2006年，在普查鸟类血清USUV抗体时，波兰发现1只棕头鸥(Larusridibundus)呈阳性[24]，捷克发现1只白冠鸡(Fulicaatra)呈阳性[25]。同年，瑞士苏黎世动物园发现鸮形目的乌鸦、雪鸮和猫头鹰病死鸟中USUV核酸呈阳性[26]，并在接下来的3年持续监测中均发现鸟类感染USUV。2006-2007年，对中欧国家的维也纳、巴塞尔和苏黎世地区动物园及布达佩地区捕获的372只鸟只血清USUV抗体监测中，阳性率分别为8.75%，6.59%，5.3%和0%，其中阳性率最高是雪鸮(Buboscandiaca)[27]。

2006-2008年夏季期间，学者在意大利北部监测鸟类USUV流行情况，在2只乌鸫和3只雪鸮体内检出USUV核酸阳性[28]。2008-2009年，意大利北部地区每年对1000只野鸟监测USUV抗体，分别检出11份和12份阳性样品[29]。在接着的2012-2013年的笑血清抗体监测中，在47种鸟类的297份样品中检出4份USUV抗体阳性样品[30]。

2011年6月开始，德国西南地区陆续发现大量的死亡鸟类，对死亡的86只6种鸟类进行检测，18只乌鸫分离出USUV[31]，接下来的几年，该地区也陆续在鸟类中检测出USUV[32]。2011年1月至9月，塞尔维亚伏伊伏丁那(Vojvodina)省对鸟类感染WNV流行性普查，共收集92份鸟类血样，对其中12血样检测USUV时，发现1份血样中各抗体阳性[33]。2011年10月至2012年2月，西班牙南部加的斯(Cádiz)在猎鸟季对捕获的159只红腿鹧鸪(Alectorisrufa)和13只雉鸡(Phasianuscolchicus)进行USUV中和抗体普查，阳性率分别为6.92%(11/159)和 63.64%(7/13)，结果表明雉鸡感染高[34]。同样在西班牙南部，2012年2月，2只出现神经症状且被捕获后短期死亡的候鸟欧歌鸫(Turdusphilomelos)均被检测出USUV核酸阳性[35]。2011年，捷克布尔诺(Brno)在1只死亡的乌鸫体内分离到USUV，1年后，同样在布尔诺，2只死亡乌鸫又被分离出USUV[36]，2012年10月，比利时默斯谷(Meuse Valley)捕获的1只3岁红腹灰雀(Pyrrhula pyrrhula)和1只成年大斑啄木鸟(Dendrocopos major)被检出USUV核酸阳性[37]。2012年10月-2013年4月，波兰对16只鸟血清样本监测USUV中和抗体时，发现1例苍鹰(Accipitergentilis)阳性[38]。

2014年，希腊学者发表一篇关于WNV在其国内流行情况文章，于2010年-2011年通过两次监测家鸽中WNV血清抗体水平与人感染WNV相关性时，发现1份2010年11月17日采集的样品USUV中和抗体阳性[39]。2015年，法国鸟类监测网络的2个点发现乌鸫死亡比平时高，一个是靠近德国的上莱菌(Haut-Rhin)附近，一个罗讷(Rhöne)，通过检测，在3只死亡乌鸫中分离出USUV[40]。

2016年3月，荷兰在监测鸟类虫媒病毒时，发现在格尔德兰(Gelderland)省瓦赫宁恩(Wageningen)采集2只乌鸫喉拭子USUV监测结果为阳性，8月份至9月份，出现病症及死亡的鸟类增多，陆续在乌鸫和乌林鸮(Strixnebulosa)体内检测出USUV核酸[41]。同年夏季，比利时、法国、德国和荷兰针对出现USUV症状及死亡鸟类逐渐增多情况下，启动USUV在鸟类流行情况调查，17只活鸟样品和147只死亡鸟只被检出USUV核酸阳性[42]。另外，德国国家野生鸟类监测网络在2016年收集100只死亡或濒临死亡野鸟组织样本，73只被检出USUV核酸阳性[43]。

目前，在欧洲10个国家的鸟类中发现USUV，见表1。考虑USUV和WNV抗体的交叉反应，表1以病毒分离或检出病毒核酸阳性作为诊断依据。非洲的摩洛哥、突尼斯、欧洲的波兰和希腊虽然在鸟类血液中检出USUV抗体阳性，但不在表1中列出。

2.3人 1981年，发现首例人类感染USUV病例，USUV在中非一个出现发热和皮疹症状病人分离出来。2004年，一名布基纳法索(非洲国家)男孩身上分离到USUV[4]，证实感染USUV。

表1 各国或地区鸟类首次感染USUV一览表Tab.1 The first detection USUV among avian species in world

2009年，意大利报道在一名病人证实感染了USUV[5]，这是在欧洲发现的首例人感染USUV病例，该名60岁的女患者出现大脑功能受损的神经症状，通过Vero E6细胞在病人血浆分离出USUV[44]。同年，一名接受过肝移植的意大利女性病人出现血栓性血小板减少性紫癜也被证实感染USUV。从这以后，直到2013年克罗地亚暴发西尼罗病毒病时期，在普查8月30日-9月7日采集样品中检测WNV和USUV时，从3名分别为29岁、56岁、61岁病人血液中检测出USUV[45-46]。2012年，意大利博洛尼亚大学学者普查359份献血者血样时，发现4份血样中IgG阳性[47]，阳性率对献血者的跟踪调查4个月，均未发现发热症状。意大利博洛尼亚St Orsola-Malpighi大学医院对中北部地区6 000份献血者血液中检出14份IgG阳性血样[48]，结果表明USUV在人群中呈隐性感染。

为进一步了解USUV感染人的情况，意大利莫利塞人畜共患病研究所西尼罗病OIE参考实验室对意大利泰拉莫地区2008-2011年出现就诊患者保存的血液样本进行追溯性普查，从306份脊髓液中检出8份核酸阳性样品；609份血样中检出2份核酸阳性样品和40份中和抗体阳性样品[49]，同样证实USUV在人群中存在。

2012年，德国对1月份收集的4 200份捐献的血样进行USUVIgG和IgM抗体筛查，检出1例抗体阳性[50]。德国在2016年6月1日-12月31日对13 023份捐献的血样普查WNV核酸时，9月26日的1例血样呈阳性，接着对该献血者进行跟踪调查，在11月20日复查的血样中检出USUV核酸，证实该献血者感染USUV[51]。

针对2016年法国、荷兰、比利时和德国均发现较多鸟类感染USUV，法国在5月至11月进行了一项人群感染WNV和USUV与蚊子活跃期相关性普查。筛选性共抽取具有明显神经症状的666名患者脊髓液进行USUV筛查。2016年11月10日，在一名3 d前伴有突发性神经症状的39岁男性患者的脊髓液中PCR检测USUV核酸呈阳性反应，样品接种非洲绿猴Vero细胞和原代人星形胶质细胞也确诊为阳性[52]。但该名患者的血样样品中PCR和抗体检测均呈阴性，推测其感染USUV时间较短，病毒在血液中含量非常低，同时也未有足够时间产生抗体。

2017年7月至8月，奥地利研究人员对这期间捐献的12 047份血样进行USUV普查，检出6份USUV核酸阳性血样，并且进行了序列谱系分析，均属于欧洲2型USUV[53]。

自从USUV传入欧洲地区以来，特别是在2009年发现人感染USUV病例后[5]，随后的时间陆续发现人感染USUV病例，见表2。与USUV感染鸟类或蚊子携带USUV趋于同步，引起欧洲各国卫生部门的高度重视，个别国家通过监测献血者样品的来获取人USUV感染数据，用于评估是否将USUV检测纳入捐献血液的卫生指标。

2.4其它动物 类似其它黄病毒，USUV还在其它动物体内被发现。2008年至2009年，意大利实施了一个马、鸡、野鸟和蚊子中WNV和USUV国家监测项目，在马的血清检出USUV抗体，阳性率21.5%[54]。2009-2010年，塞尔维亚普查WNV在马匹中流行情况时，检出一份高滴度USUV中和抗体样品[55]。2011年，克罗地亚在69份马匹血样中检出2份阳性USUV中和抗体[56]。2011年至2012年，西班牙马略卡岛(Mallorca)对马匹普查USUV血清抗体时，检出1.2%的阳性率[57]。2012年，摩洛哥对军马和军犬普查主要黄病毒流行情况时，发现马匹血清中USUV抗体阳性率达60%，而军犬的阳性更高达62%[58]，推测犬类也可感染USUV。同年，突尼斯对284份马匹血清普查WNV和USUV抗体时，检出10份USUV阳性抗体[59]。

表2 各国或地区人类感染USUV一览表Tab.2 List of countries or regions with human infection of USUV

a. 样品采集时间2009年6月至2009年10月，血液样品数量359份；b. 样品采集时间2010年9月1日至2011年6月30日，血液样品数量6 000份；c. 样品采集时间2012年1月，血液样品数量4200份；d. 样品采集时间2008年至2009年，脊髓液样品数量306份；e. 样品采集时间2008年至2011年，血液样品数量609份；f. 样品采集时间2016年至1月1日至12月31日，血液样品数量13 023份；g. 样品采集时间2016年11月至10月；h. 样品采集时间2017年7月至8月，血液样品数量12 047份

2011年至2012年，塞尔维亚在普查WNV在猪、野猪和狍动物中流行情况时，同时对部分样品监测USUV抗体，在4头野猪血样中检出USUV抗体[60]。

2013年，德国在2只死亡的伏翼属(Pipistrellus bats)蝙蝠组织中检出USUV核酸，进一步测出全基因序列通过序列比较属于欧洲3系USUV[61]。

2003年至2014年，西班牙对全国捕获的4 963头反刍兽类动物普查WNV和USUV流行情况，马鹿(Cervus elaphus)、欧洲小鹿(Dama dama)、绵羊(Ovis aries musimon)和狍子(Capreolus capreolus)血清USUV抗体阳性率为0.1%～0.2%[62]。

3 易感细胞

猪肾细胞(PS)最先被证实可用于培养分离USUV的细胞，USUV可致PS细胞发生病变[63]。通过在人类(HeLa)、绿猴(Vero)、马(ED)、牛(MDBK)、猪(PK-15)、兔(RK-13)、犬(MDCK, DK)、猫(CR)、仓鼠(BHK-21, BF)、老鼠(C6)和海龟(TH1)等亲本细胞及马肾原细胞(EqK)、鹅胚成纤维细胞(GEF)、鸡胚成纤维细胞(CEF)的培养分离试验表明，病毒在所有上述哺乳动物均可复制，但只有Vero 、PK-15和GEF3种细胞发生病变[64]。德国学者通过试验证实堤岸田鼠(Myodes glareolus,Bank voles)肾细胞也可用于USUV的分离或增殖[65]。随着人类对新出现黄病毒的研究，发现13种细胞系对USUV和寨卡病毒(Zika Virus)易感，包括Tb 1 Lu、 DF-1、Sf 1 Ep、 EA.hy.926、FoLu,、Pl 1 Ut、OHH1.K、OK、DN1.Tr、LLC-MK2、BT、WCH-17和Mv 1 Lu细胞系[66]。

另外，体外试验显示USUV对人神经元、小神经胶质等神经细胞和人神经干细胞有明显的致病性，表现出强烈的细胞毒性[67]。USUV可在不同动物细胞中培养分离，进一步揭示其感染传播的范围，即可在传播媒介蚊子中存在，也可以在鸟类等脊椎动物中传播，也可能存在哺乳动物中循环传播。

4 临床症状

目前，动物感染USUV后临床症状的信息比较少。雀形目的鸟类感染USUV表现为沉郁、羽毛蓬乱、共济失调，并急性死亡等症状[26]。因感染USUV死亡的鸟类解剖可见肝脏和脾脏出现中度充血肿大，在脾脏不同程度出现坏死病灶，组织病理切片进一步显示肝脏有严重炎症及坏死病灶；心脏和肾脏病理切片出现血管周围有局部灶性淋巴组织细胞浸润，心肌出现轻微炎症[26,28]；有些病例出现轻度急性坏死性肾炎，灶性间质淋巴组织细胞浸润，肾小管上皮细胞散在坏死[7]。一些死亡鸟只肠道解剖有严重的急性卡他性肠炎[21]。脑部病理组织切片出现神经元和浦肯野细胞坏死，胶质变性[35]，脑部血管出现炎，血管内外可见白细胞溶解[26]。

由于人感染USUV出现临床症状的数量不多，在非洲感染的病人的主要表现为高热、神经症状，皮疹、黄疸[4]；在欧洲感染的病人临床表现为头痛、发热、颈强直和手颤等症状[44]，另外患者可能伴有脑膜炎[5]；法国最近发现的患者则出现四肢渐进性麻痹、面瘫和眼睑下垂等神经症状[52]；在捐献血液中检出USUV的献血者没有症状，基本呈隐性感染状态。

5 诊 断

病毒分离是最基本的诊断方法，猪肾细胞(PS)、Vero 、PK-15和GEF等细胞均可用于USUV分离培养[64]。由于USUV属于黄病毒，且可感染人，对人有一定的致病能力，病毒分离对实验生物安全要求高，且病毒分离试验时间长和对设备要求高，只适合在确诊实验室开展。

病毒中和试验和ELISA方法是发现人兽动物感染USUV病毒状况的血清学检测方法，但由于该病毒与其他黄病毒存在血清学交叉反应，因此在检测时要注意排除与同属其它黄病毒交叉反应的现象。一种通过重组NS1蛋白用于检测血清中IgG抗体的ELISA试剂盒已商品化，适用于USUV的常规普查[68]。

PCR方法在USUV检测诊断显示快速和准确的特性，主要是根据病毒NS5基因的保守性设计研究。其中荧光定量RT-PCR方法在欧洲的鸟类开始流行时就建立[68]；RT-PCR方法目前在人血样和细胞分离培养样品中可检测每个反应50个拷贝，相当于2 000个拷贝/mL浓度[69]；另外，已建立一步法的多重RT-PCR可同时鉴别WNV和USUV[70]。用于诊断USUV的PCR方法在普查和作为验证方法方面显示其快速的优势，但目前还没有商品化的试剂盒。

从目前发现的USUV分析，基本都是在监测多种黄病毒属病毒时发现人类感染USUV。由于人类感染USUV时症状不明显，往往会出现漏诊的情况。建议在鸟类常发生感染USUV地区，在蚊子活跃时期，在做好蚊子中携带WNV、寨卡和USUV普查的同时，对该地区的发热和出现神经症状的病人进行同时进行WNV、寨卡和USUV检测，提高USUV的检出率。

6 展 望

随着USUV感染人类病例增多，近几年逐步引起部分国家公共卫生部门的重视。迄今仍没有针对USUV疫苗研制的报道。但针对近年来出现的黄病毒属如WNV和寨卡病毒等疫苗的研究目前正成为各国科学家研究的热点。已有的成果显示WNV的疫苗在成年白鼠体内可诱导产生的低浓度的IgG抗体，可与USUV产生交叉反应。重组USUV膜蛋白(prM/M)和囊蛋白(E)也诱导产生抗USUV的中和抗体，可作为疫苗研究的一种候选方式[71]。

USUV属于黄病毒，并且对人类有一定的致病力，可通过蚊子的叮咬随意传播，应该引起足够的重视。特别是现在各国人流的频繁流动，在疫源地的蚊子、鸟类、隐性感染动物或人群均可能传播USUV。同时，应加强国境卫生检疫和动物检疫，防止USUV的传入和扩散。条件成熟的边境口岸应制定USUV的监测计划，在条件允许情况下对从非洲或欧洲进境的鸟类进行抽样监测USUV，为进一步的风险评估及突发疫情提供真实、全面的数据。

收稿日期：2018-05-08编辑：张智芳