棉花盐胁迫应答基因GhEXO70B1功能分析

丁颜朋 ，葛晓阳 ，王鹏 ，吴洁 ，王省芬 ，李付广 *

（1.河北农业大学／棉花生物学国家重点实验室河北基地，河北保定071001；2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，安阳河南455000）

棉花是世界重要的经济作物之一，在我国国民经济中占有重要的地位，是广大棉农最重要的经济来源，是广大人民群众不可或缺的生活必需品[1]，也是世界第二大纺织工业原料和食用油原料。

影响棉花产量的因素有多种，种植机械化程度低，棉花品种抗虫、抗逆性差，纤维品质差等一直制约着我国棉花的生产[2]。近年来土壤盐渍化和干旱等因素严重制约着棉花的产量和品质[3-5]。新疆作为我国棉花种植面积最大的省区，其土壤盐渍化的问题日益严重[6]。传统方法选育的耐盐棉花新品种由于适应性差，无法适应我国大面积多类型的盐碱地。随着现代生物技术的迅速发展，利用分子育种可以通过挖掘棉花自身与耐盐相关的基因进行遗传转化，改良棉花的农艺性状，快速获得耐盐新品种。该技术已经成为解决上述问题的有效手段。随着四大棉种（雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉、海岛棉）全基因组测序工作以及最近三代测序的完成，棉花的遗传学研究进入功能基因组时代。在现有的成熟转基因技术平台下，通过数据分析潜在有价值的基因进行转化并研究功能，提高棉花在逆境中生存的能力，可在短时间内为育种及研究提供许多优良的材料[7-9]。近年来，通过各种技术手段，越来越多应对生物胁迫和非生物胁迫的基因被鉴定。其中，EXO70作为胞外分泌复合物成为研究的热点，它是调节分泌囊泡转运的重要蛋白复合物[10]，早期发现于酵母中，随后在陆生植物中发现大量的EXO70旁系同源基因，这对于陆生植物而言是独一无二的[11]。在真核细胞的内膜系统中所有的运输步骤，运输囊泡与目标内膜第一次接触是由特定的束缚因子EXO70介导的。EXO70s（EXO70.3）的1个整体类型在夜蛾进化早期过程中消失，EXO70的进化速度和程度表明其可能与胁迫、生物相互作用有关[12]。

在拟南芥中，EXO70的蛋白家族有23个成员，其组成的胞外复合物具有多种功能，不仅调节胞吐、质膜循环和自噬相关的液泡导向运输或质外体运输，还参与应激反应相关的胞吐作用，例如病原体攻击和非生物胁迫等[13-14]。

EXO70B1编码1个八聚体蛋白复合物[15]。拟南芥中EXO70B1对自噬体运输有很重要的作用，它识别细胞质中的囊泡并内化到中央液泡内，且与自噬体标记物ATG8f共定位于大液泡内[10,16]。EXO70B1功能丧失会导致液泡内部自噬体的数量减少，同时伴随着异位超敏反应。研究表明，EXO70蛋白在拟南芥的免疫功能中起重要作用，在生物胁迫下，EXO70B1的突变体表现为过敏反应，为防止病原菌扩散表现出程序性死亡[17]。关于EXO70B1基因的功能在拟南芥中研究较多，而且大多是在生物胁迫下的免疫调节中扮演重要角色，但在非生物胁迫中的研究较少。Poustka等发现：EXO70E2与EXO70B1在生物胁迫和非生物胁迫中的表达模式相似，而EXO70E2还涉及非生物胁迫，如氧化应激、高温和冷冻胁迫[18]。Zársk等的研究表明，EXO70B1功能完全不同于EXO70A1这类行使胞吐功能的胞外亚基，其在自噬运输中具有特定的作用[10,19]。

通过介导自噬来调节生物胁迫和非生物胁迫的研究在棉花中未见报道。本研究通过对TM-1转录组数据的分析发现，GhEXO70B1基因在高温、干旱、盐等非生物胁迫中表达量均表现为上调。通过对该基因的生物信息学分析以及初步的功能验证分析，证实了GhEXO70B1基因正调控棉花耐盐性，为明确GhEXO70B1基因在陆地棉非生物胁迫应答中的调控机制提供理论依据，为耐盐品种的选育提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验中用的棉花材料为陆地棉品种中棉所24。烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）干扰表达载体pYL-156、辅助载体pYL-192。

T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Taq聚合酶和dNTPs、cDNA反转录试剂盒均购自TaKaRa公司，卡那霉素和利福平等抗生素购自Sigma公司，植物总RNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技公司，聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）产物回收纯化试剂盒、胶回收试剂盒和大肠杆菌感受态DH5a购自北京全式金公司，脯氨酸测试盒和丙二醛测试盒购自南京建成生物工程研究所，台盼蓝试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。引物合成及测序均由北京金唯智公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1GhEXO70B1的基因克隆。采用改良CTAB法[20]提取陆地棉总RNA。利用植物总RNA提取试剂盒对陆地棉的根、茎、叶的混合材料进行总RNA的提取并测浓度。取2 μg的总RNA进行第一链cDNA的合成。使用TaKaRa公司的Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect real time）试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，具体方法参照试剂盒说明书。根据GhEXO70B1基因的编码序列在primer premier 5软件上设计引物GhEXO70B1-F和GhEXO70B1-R（表1），通过PCR扩增获得GhEXO70B1基因，然后对扩增的PCR产物纯化回收，连接T载体后送公司测序。

1.2.2生物信息学分析。使用DNAMAN软件进行核苷酸序列多序列分析和比对，利用MEGA6软件构建进化树，利用CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对蛋白保守域进行预测，利用EXPASY工具（http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool）对蛋白质的相对分子质量（Mr）和理论等电点等进行分析。利用 SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结构预测。

1.2.3定量反转录（Quantitative reverse transcrip-tion，qRT）-PCR分析。采用CTAB法[20]提取的总RNA反转录合成的cDNA为模板以GhHistone3作为内参基因（表1），Real-time PCR分析GhEXO70B1基因在棉花不同组织的表达模式以及在盐胁迫下不同组织（根、茎、叶）中不同时间的表达模式，Real-time PCR反应体系和反应程序按照SYBR Premix ExTaq（DRR041A）荧光定量试剂盒说明书进行加样和设置。每个反应3次重复。获得结果采用2－△△Ct计算基因的相对表达量，利用GraphPad Prism 5软件作图。

1.2.4病毒诱导GhEXO70B1基因沉默。利用TRV病毒诱导基因沉默 （Virus-induced gene silencing，VIGS）技术对棉花GhEXO70B1基因进行沉默，以克隆的GhEXO70B1基因作为模板，利用Primer premier 5软件在保守结构域外设计引物进行PCR扩增，扩增的目的基因片段大小为269 bp，将片段纯化后通过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切连接到pYL-156-EXO70B1，测序验证后导入农杆菌GV3101中。将分别含有pYL-156-EXO70B1、pYL-156、pYL-192 和正对照 pTRV-PDS的农杆菌GV3101在Kan与Rif液体LB培养基中过夜培养，至OD值在1.8～2.2，离心后用重悬液（MES 0.5 mol·L－1、AS 200 mmol·L－1、MgCl21 mol·L－1）重悬菌体，并调整OD600在 1.5 左右，然后分别将pYL-156-EXO70B1、pYL-156及正对照菌液与pYL-192菌液按体积1∶1混合，在25℃条件下静置3 h后注射棉花子叶（在25℃，光照、黑暗时间分别为16h、8h，温室生长9d的幼苗），其中正对照注射样本10株，试验组（pYL-156-EXO70B1）和对照组（pYL-156）注射样本分别为30株，注射后黑暗处理24 h，然后将棉株放置于温室正常培养，12 d后正对照真叶呈现白化表型，对试验组和对照组分别取样进行基因沉默效率分析，与此同时，试验组和对照组分别进行盐处理，盐浓度为 200 mmol·L－1，每株自上而下缓慢浇注100 mL盐水。试验重复3次。

1.2.5脯氨酸和丙二醛含量测定。精确称量植物组织，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例，加入9倍体积的0.9%（质量分数，下同）生理盐水，冰水浴条件下进行机械匀浆，制成10%（体积分数）的组织匀浆，在离心机上4 000 r·min－1离心10 min，取上清液待测，高盐胁迫处理则用0.9%生理盐水稀释成1%（体积分数）待测。脯氨酸测定方法：分别设空白管、标准管和测定管，待测管依次加入试剂后沸水浴30 min，然后流水冷却，然后测定并记录OD值。测定样本蛋白含量方法：分别设空白管、标准管和测试管，用考马斯亮蓝测试法进行测定；丙二醛含量测定方法：分别设空白管、标准管和测试管，首先，加入试剂一混匀，然后加试剂二和试剂三（详细步骤请参考南京建成生物工程研究所丙二醛测试盒说明书），待测管在95℃水浴40 min，取出后用流水冷却，在离心机上 4 000 r·min－1离心 10 min，然后取上清液，测各管吸光度值，根据公式计算各生化指标。试验重复3次。

1.2.6数据分析。脯氨酸含量（μg·g－1）=（测定OD值－空白OD值）/（标准OD值－空白OD值）×标准品质量浓度（5 mg·L－1）/匀浆液质量浓度（g·mL－1）×样本测试前稀释倍数；匀浆液质量浓度（g·mL－1）=组织质量（g）/提取液总体积（mL）。丙二醛含量 （μmol·g－1）=（测定OD值－空白OD值）/（标准OD值－空白OD值）×标准品浓度（10 μmol·L－1）/ 待测样本蛋白的质量浓度 （g·L－1）；蛋白的质量浓度（g·L－1）=（测定OD值－空白OD值）/（标准OD值－空白OD值）×标准品质量浓度 （0.563 g·L－1）。制图和显著性分析用GraphPad Prism 5软件进行。

1.2.7台盼蓝染色。台盼蓝染色观察植物的细胞死亡情况[21]。取胁迫后25d的叶片为试验材料，将其浸泡在台盼蓝染料（1 g苯酚，1 mg台盼蓝，1 mL乳酸和1 mL甘油溶解在1 mL的无菌蒸馏水中制成染液）中，然后煮沸5 min染色。冷却至室温后，将样品用水合氯醛水溶液（2.5 g·mL－1）脱色。

表1 本研究中涉及的引物信息Table 1 The details of primers used in this study

2 结果与分析

2.1 GhEXO70B1基因的克隆及特征分析

在NCBI数据库中，用拟南芥AtEXO70B1氨基酸序列比对陆地棉序列，获得陆地棉同源序列（Gh_A03G0212，Gh_D03G1369）。获得GhEXO70B1基因的开放阅读框 （Open reading frame，ORF）全长序列。用合成的引物以cDNA第一链为模板对GhEXO70B1（Gh_A03G0212）基因进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出大约1.9 kb的条带。对该片段进行回收克隆后进行序列测定。将测定的序列在数据库中进行比较，和大多数生物的EXO70B1基因同源性很高，所以把该基因定名为GhEXO70B1，其开放阅读框长度为1 923 bp，编码640个氨基酸残基。

选取双子叶植物拟南芥（Arabidopsisthaliana）、苹果（Malus domestica）、花生（Arachis hypogaea），单子叶植物水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）与陆地棉（Gossypium hirsutumL.）的相关序列进行比对（图1），发现陆地棉GhEXO70B1基因编码的氨基酸序列与以上物种相似度较高，表明该蛋白在进化过程中较为保守；用MEGA6软件绘制系统进化树，结果（图2）表明GhEXO70B1蛋白与拟南芥的EXO70B1蛋白同源性较高。

利用SOPMA在线软件对陆地棉EXO70B1蛋白的氨基酸序列二级结构进行预测。结果表明，该蛋白主要由α-螺旋构成（表2）；利用在线网站CDD对GhEXO70B1基因编码蛋白的保守结构域进行预测，结果表明，第270～627位有1个EXO70高度保守结构域。利用EXPASY网站上的ProtParam对GhEXO70B1基因编码蛋白进行理化性质分析，结果表明，该蛋白的理论相对分子质量为72.954 kD，理论等电点为5.17，分子式为C3179H5044N912O987S35，脂肪酸系数为85.66，平均亲水性为－0.378，可能为亲水性蛋白，不稳定系数为47.20，根据Guruprasad等方法的计算结果，该蛋白为不稳定蛋白；利用SignalP 4.0 Server通过人工神经网络算法对GhEXO70B1基因编码的蛋白进行信号肽预测，该蛋白的N端至70位氨基酸之间剪切位点分值C-Value在第22位氨基酸处有峰值，分数为0.239，而其综合剪切分值Y-Value在第22位氨基酸处略有上升，但无明显峰值，说明该蛋白的N端不存在剪切位点，不包含信号肽，推测为非分泌蛋白。利用TMHMM2.0 SERVER对GhEXO70B1基因编码的蛋白进行跨膜结构预测，其中1～640个氨基酸没有峰值，表明不存在跨膜蛋白，因此，推测其不具有跨膜结构，为细胞膜外蛋白。

图1 GhEXO70B1与其他物种EXO70B1蛋白序列比对Fig.1 Multiple sequence alignment of GhEXO70B1 and other EXO70B1 proteins

图2 GhEXO70B1与其他EXO70B1蛋白进化树分析Fig.2 Phylogenetic analysis of GhEXO70B1 and other EXO70B1 proteins

表2 GhEXO70B1的二级结构预测Table 2 Secondary structure prediction of GhEXO70B1

2.2 GhEXO70B1基因在各个组织和盐胁迫下的组织表达模式分析

提取三叶期棉花的根、茎、叶及花、胚珠、开花 5 d（5 DPA）的纤维和开花 10 d（10 DPA）的纤维进行组织特异性表达分析。结果（图3-A）表明，该基因在茎和根中的表达量较高，在纤维中的表达量低。

受到盐胁迫后，GhEXO70B1在不同组织中的表达均表现出不同程度的上调，但在组织中的应答模式存在差异（图3）。根系中受胁迫24 h时表达量达到最大值，整体表现为先升后降 （图3-B）；茎中的表达量与根中类似，但表达的峰值出现在胁迫处理6 h时（图3-C）。叶片中则出现了2次的应答高峰，第一次在盐胁迫处理6 h时，第2次是盐胁迫处理24 h时（图3-D）。从根、茎、叶3个组织中GhEXO70B1的表达趋势发现，在48 h时其表达量均下降，因此推测该基因主要参与盐胁迫的早期应答。

2.3 GhEXO70B1基因被沉默后的表型分析

利用VIGS技术对棉花的GhEXO70B1基因进行沉默，盐处理后观察其表型[22]（图4）。当病毒接种12 d后，阳性对照植株（沉默八氢番茄红素脱氢酶基因GhPDS）叶片呈现花白斑或白化表型（图4-A）时，采取试验组植株真叶进行qRT-PCR分析，结果表明：GhEXO70B1基因被成功沉默（图4-B）。然后对沉默GhEXO70B1基因的植株进行盐胁迫处理。分别用200 mmol·L－1NaCl缓慢浇灌试验组中基因沉默的植株和注射空载体植株，处理第24天时，观察发现注射空载体植株的叶片基本正常，而被沉默GhEXO70B1基因的植株叶片则呈现出发黄、萎蔫、干枯的现象（图4-C，D）。

图3 不同组织中GhEXO70B1的表达分析（A）和GhEXO70B1基因在盐胁迫不同时间棉花根（B）、茎（C）、叶（D）中的表达模式Fig.3 Analysis ofGhEXO70B1 expression level in different cotton tissues and expression profile of GhEXO70B1 in roots（A）,stems（B）,leaves（C）under salt treatments

2.4 病毒诱导基因沉默后生理生化结果分析

分别对注射空载体的植株和沉默目的基因的植株的叶片做脯氨酸和丙二醛含量测定。在盐胁迫20 d时沉默目的基因的植株的脯氨酸含量，相较于注射空载体植株显著降低（图5-A），丙二醛的含量则升高（图5-B）。目的基因被沉默后的植株，随着盐胁迫时间延长，叶片组织中的有毒有害物质不能及时自我调节消化，进而导致叶片细胞死亡，而用台盼蓝染色的方法可以清晰显示组织中死亡细胞的情况。本研究对盐胁迫处理24 d注射空载体的植株和沉默目的基因的植株叶片进行了台盼蓝染色，染色结果见图5-C～F。由图5可知，相较于注射空载体植株的叶片，沉默目的基因植株的叶片有大片区域被台盼蓝着色，说明目的基因沉默后在盐胁迫下植株叶片死亡细胞显著增加，不能有效应对盐胁迫的伤害。

2.5 盐胁迫下GhEXO70B1基因的共表达网络分析

图4 GhEXO70B1基因表达沉默棉株对盐胁迫的响应Fig.4 Response ofGhEXO70B1 silenced cotton plants under salt stress

利用ccNET数据库下载GhEXO70B1的共表达网络。GhEXO70B1基因在盐胁迫下1h、3h、6h和12h的共表达网络显示：在盐胁迫下共有25个基因参与共表达，参与表达的主要有EXO70家族基因（Gh_A13G1577、Gh_D03G1369）、锌指类蛋白基因（Gh_D04G1179、Gh_A04G0712、Gh_A11G 3256）、蛋白激酶基因（Gh_A05G1997、Gh_A04GO 333）、GRAS 转录因子基因 （Gh_A06G1468）和bZIP转录因子基因（Gh_A13G2071、Gh_A01G 1472）等（图 6）。bZIP17（Gh_A13G2071）响应盐和渗透压胁迫，在zip17突变体中一些盐响应基因在盐处理下转录受到抑制，增强NaCl抑制的初级根伸长。此外，bZIP28和bZIP60在维持盐响应基因的稳定表达方面也发挥重要作用[23]。MAPKKK或MAP3K（Gh_A05G1997）为促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶，介导冷、盐、镉和创伤压力信号。干旱胁迫条件下，通过GhMAP3K15-GhMKK4-GhMPK6激酶串联反应，直接磷酸化GhWRKY59，GhWRKY59 直接绑定 GhDREB2的W-box蛋白，进而调节植物激素脱落酸（ABA）信号通路[24]。GRAS转录因子在植物生长发育过程中发挥着重要作用，尤其在应对盐和干旱胁迫中尤为重要[25]。GhSCL14（Gh_A06G1468）作为GRAS家族基因的一员，在盐胁迫6 h的共表达网络中上调表达，推测该基因参与了GhEXO70B1基因响应的盐胁迫应答。由共表达网络推测，以上基因都可能参与GhEXO70B1基因响应的盐胁迫应答，但具体如何与GhEXO70B1基因相互作用响应盐胁迫应答还需进一步研究。

3 讨论

盐碱、高温、干旱和低温冷冻等非生物胁迫对植物的生长及产量造成了严重的影响，植物则通过自身一系列的生理生化过程来调节适应胁迫[26]。植物细胞自噬的高效降解系统在正常发育或环境胁迫下对细胞内有毒物质的清除和再循环具有重要作用。自噬是植物本身具有的1种应对外界环境进行自我生理调节的功能，在植株整个生长发育过程中，尤其在多重非生物胁迫和生物胁迫中有重要意义。

图5 盐胁迫下注射空载体棉株TRV::00和沉默目的基因棉株TRV::GhEXO70B1脯氨酸（A）、丙二醛（B）含量和台盼蓝染色结果（C～F）Fig.5 The proline（A）,malonaldehyde（B） content and trypan blue staining results（C-F）of both control cotton plants silenced with empty vector andGhEXO70B1 silenced cotton plants under salt stress

本研究从陆地棉中克隆了1个介导自噬的基因GhEXO70B1，通过序列多重比对和进化树分析，确定GhEXO70B1基因编码的序列与拟南芥AtEXO70B1蛋白序列存在较高的同源性，并确定为棉花EXO类蛋白的新成员。首次在棉花中对该基因的功能进行验证，证实GhEXO70B1在棉花应对盐胁迫过程中发挥重要作用。最近在动物和植物中均发现，自噬过程中涉及胞外复合物，这揭示了胞吐作用不仅出现在质膜运输中，还出现在与自噬相关的内膜运送系统中[27-28]。这使得胞外复合体成为介导囊泡输送途径的识别蛋白，并有可能对质膜以及胞质的膜系统之间蛋白传递起到重要作用。

本研究根据该基因在盐胁迫下不同组织不同时间的差异表达情况推测：它主要参与盐胁迫的早期应答；随着盐胁迫时间的延长，该基因可能存在由负反馈调节引起的自身抑制现象，因为在盐胁迫处理48 h时，GhEXO70B1基因在根、茎和叶中均下调表达。

植物的内膜运输系统是植物应对环境影响而主动进行自我调节的1种防御系统，EXO70在复杂的内膜运输系统中扮演重要的角色，尤其是EXO70B1介导的自噬膜运输即EXO70B1与SEC5和EXO84互作形成胞外亚基复合物介导囊泡包裹的有害物质从内膜运输至液泡膜并内化至液泡自噬[18,29]。本研究利用VIGS技术首次在棉花中对该基因的功能进行验证，证实GhEXO70B1基因在棉花应对盐胁迫过程中发挥重要作用。我们推测在盐胁迫下注射空载体的棉株中GhEXO70B1蛋白在细胞中正常发挥作用，通过与SEC5和EXO84互作形成复合物引导囊泡包裹的有毒有害物质运输至液泡膜并内化到液泡内进行自噬，及时清除在环境胁迫下细胞产生的有害物质（图7-A），进而维持细胞活力。因此，该植株叶片不能被台盼蓝染色。GhEXO70B1基因被沉默后转录水平显著下降（图4-B），在盐胁迫下，细胞内只有少量的有毒有害物质被GhEXO70B1蛋白引导至液泡内自噬，大量的有毒物质则滞留在细胞质中无法及时清除（图7-B），导致植物细胞大量死亡，因此该植株叶片能够被台盼蓝染色。但该基因具体如何参与调控棉花响应胁迫应答仍需要进一步深入的研究。

图6 盐胁迫下GhEXO70B1共表达网络Fig.6 GhEXO70B1 coexpression network under salt stress

图7 GhEXO70B1在细胞中自噬运输的模式图Fig.7 The model ofGhEXO70B1 dependent autophagy related transport to vacuole in the cell

GhEXO70B1基因是介导自噬功能的相关基因，VIGS沉默后棉株出现敏盐的表型，暗示该基因可能通过介导细胞自噬来响应非生物胁迫；EXO70B1基因在拟南芥中与生物胁迫密切相关，由此我们推测GhEXO70B1基因在生物胁迫下也有一定的功能，这还需要进一步探索研究。

4 结论

从陆地棉中克隆出1个新基因GhEXO70B1，ORF长1 923 bp，编码640个氨基酸残基。GhEXO70B1不具跨膜结构，为非分泌蛋白，在进化中功能高度保守。该基因在茎和叶中表达量较高，盐胁迫处理诱导其上调表达。利用VIGS技术首次在棉花中对该基因的功能进行验证，证实GhEXO70B1在棉花应对盐胁迫过程中发挥重要作用。GhEXO70B1基因与自噬相关，我们推测该基因介导细胞自噬来应对逆境胁迫。