通过去除花丝确定玉米花粉管通道形成时间

李向龙， 张中保， 张 春， 吴忠义

(北京市农林科学院生物中心/北京市农业基因资源与生物技术重点实验室，北京 100097)

花粉管通道法于1983年由周光宇创立，因其无须组培和植株再生，且技术相对简单、对设备要求低，在玉米转基因育种中得到了广泛应用[1-4]。该方法利用花丝授粉萌发形成的花粉管通道将生殖细胞的DNA输入卵细胞并最终转化成合子或早期胚胎细胞[5]。前人利用花粉管通道法进行玉米转化并获得了阳性植株[6-7]，转化时间差异较大，从授粉后6～36 h开始转化均有报道，可能是因为在实际操作过程中转化材料和外界环境不同造成的。

玉米花粉管通道法通道打通时间段如何确定，是该方法获得较高转化效率的关键。张雅君等通过苯胺蓝染色法和GeneFinderTM核酸染料对玉米花粉管伸长进程和导入路径进行了研究[8-9]，但由于花粉管通道形成受很多自然因素影响，造成了通道形成时间在材料间有差异。由于花粉管通道只有完全打通，玉米才能正常结实，因此通过结实始末时间可以断定通道打通至关闭的时间段，在该时间段进行外源DNA导入，转化效率最高。本研究借助该思路对2个玉米试验材料在不同月份、不同温度下去除花丝，考察其结实粒数，初步确定其通道打开时间段、受温度影响规律及最佳转化时间，以期为花粉管通道法应用于玉米转基因育种提供有效方法和指导依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地点设在海南省三亚市崖州区。本研究供试玉米材料为S173、S192，均由北京市农林科学院生物中心选育，为近几年花粉管通道法转化试验的骨干材料。

1.2 试验设计

为观察2个试验材料间花粉管通道形成时间段及受温度影响的规律，分别于2015年1月16—20日、3月1—5日、12月26—30日在2个玉米自交系开花前严格套袋，避免花粉提前落到花丝上；在花丝长至一定程度进行授粉，授粉后从3 h开始每隔2 h去除1次花丝，直至授粉后31 h结束，重复3次，每个重复6穗，以同时段授粉但不去除花丝的雌穗作为对照；记录从授粉开始至去除花丝期间5 d的温度。

在2015年12月、2016年1月对2个试验材料通道形成时间规律进行初步验证，设2个处理，处理1依据之前的经验在授粉后18 h进行转化，处理2是根据分析结果依温度变幅进行调整。2016年3月对收获种子进行除草剂筛选，同时比较2个处理所得阳性株数。

1.3 试验方法

不同处理去除花丝步骤为花丝未伸出苞叶前雌穗提前套袋；花丝露出苞叶达6～7 cm时开始授粉并再次套袋，标注授粉时间；用小刀将雌穗苞叶从顶部至底部切开(图1-A)；注意不要伤及穗轴、弄断苞叶底部与穗柄连接处，将花丝去除干净(图1-B)；将苞叶恢复原状，顶部用皮筋扎好(图1-C)，标注去除花丝时间；待授粉后20 d取回雌穗，进行结实粒数统计(图1-D)，记录从授粉开始至去除花丝期间的温度。

使用Elitech RC-4HA温度记录仪记录授粉至转化期间的温度，设定每隔15 min记录1次；授粉后15 d统计去除花丝雌穗的结实粒数。

1.4 数据分析

试验数据利用Excel 2010进行整理和分析，并作图表。

2 结果与分析

2.1 不同去除花丝时间对雌穗结实部位的影响

从表1中可以看出，2个材料从授粉至13 h均未结实，与对照表现相同，表明在该时间段内其花粉管通道均未形成；2个材料雌穗结实部位与对照相似，均是从中部开始结实，再至中下部，最后整穗结实，该结果与前人就玉米雌穗结实顺序研究结果[10]一致。2个材料及对照在3个月份中开始结实的顺序依次是3、12、1月， 可能与这3个月中温度逐渐降低有关；

表1 不同去除花丝时间对雌穗结实部位的影响

注：“—”表示未结实。

在相同月份内，S192开始结实的时间段要早于S173，表明其花粉管通道形成的时间要早于S173，因此在利用花粉管通道法转化该材料时，转化时间要适当提前。

2.2 不同月份去除花丝时段的温度变化

从图2可以看出，相同月份去除花丝的5 d内温度变化不大，较为稳定；不同月份去除花丝间日均温度差异较大，3月最高，温度在26.5～27.0 ℃之间，12月次之，温度在 24.0～25.5 ℃ 之间，1月温度最低，温度在20.0～21.5 ℃之间，表明2个材料在3、12、1月间开始结实时间延迟与温度变化有很大的关系。

2.3 去除花丝时间对雌穗结实粒数的影响

2.3.1 不同月份去除花丝时间对S173结实率的影响 由图3可见，S173平均结实粒数在不同月份间都是随着去除花丝时间的推移逐渐升高，1月是从21 h开始结实至27 h处于上升过程，29 h后变得平缓，说明花粉管通道是从21 h开始形成且通道数量逐渐增多；3月试验时是从17 h开始结实，再往后结实粒数上升明显，至21 h上升平缓，说明花粉管通道是从17 h开始形成然后通道数量逐渐增多；12月是从19 h开始结实，然后结实粒数逐渐升高，23 h后上升缓慢，表明花粉管通道是在该时间段内数量较多。去除花丝试验期间温度由高到底的顺序依次为3、12、1月，可见花粉管通道形成与温度密切相关，温度越高，花粉管通道形成越早，反之则形成延迟。

2.3.2 不同月份去除花丝时间对S192结实率的影响 由图4可见，S192平均结实粒数在3次去除花丝中随时间变化的趋势与S173相似。1月结实粒数从19 h开始升高至25 h变得平缓，说明花粉管通道在此时段内打通数量较多；12月结实粒数从17 h后开始逐渐升高，至23 h后变得平缓，表明通道数量在此时间段较多；3月其开始结实较前2个月早，从 15 h 开始结实，逐渐升高后至21 h开始变得平缓，说明此时段通道打通数量较多。结果表明，S192花粉管通道打通易受温度影响，温度升高花粉管通道打开时间提前，反之则延迟。

2.4 2个玉米材料最佳转化时间确定

由表2可见，随着温度在1、12、3月3个月间不断升高，2个玉米材料在授粉后的结实时间段均有提前的趋势，说明温度对2个玉米材料结实性有较大的影响，在温度相近时，S192的结实时间段要早于S173。当日均温度为20.0～21.5 ℃时，S173结实时间段为授粉后21～27 h，表明其花粉管通道形成在该时段内处于高峰期，S192稍早，其花粉管通道形成是在授粉后19～25 h；当日均温度为24.0～25.5 ℃时，S173花粉管通道形成在授粉后19～23 h，S192在授粉后 17～21 h间处于通道形成高峰期；当日均温度为26.5～27.0 ℃ 时，S173花粉管通道授粉后17～21 h形成，S192花粉管通道在15～19 h间形成。表明花粉管通道形成时间受日均温度影响较大，只有在上述温度对应上述时间段时对2个玉米材料进行花粉管通道法转化才能达到较高的转化效果。

表2 不同温度条件下2个玉米材料确定结实时间段

2.5 通道形成时间验证

从表3中可以看出，S192在2015年12月处理1、处理2所得阳性转化率相近，由于其转化时间正好处于最佳转化时间段内。除此之外，其他处理在同期授粉和相同温度下，处理2得到阳性转化率均明显高于处理1，表明通过去除花丝法确定花粉管通道形成时间是可行的。而在授粉时间和温度均相同时，S173得到阳性转化率略高于S192，说明花粉管通道法的转化效率与受体材料有一定的关系。

3 结论与讨论

玉米正常结实的前提是花粉管通道完全打通，而通道形成也须要一个过程，虽然在此过程中先形成的通道有关闭的，但还有不断打通的，花粉管通道法须要在花粉管通道打通的高峰时间段进行转化才能获得较高的转化效率。本试验中2个材料在雌穗结实部位的顺序依次为中部、中下部、顶部，在中下部结实时结实数较多，说明花粉管通道形成较多。

表3 2个材料在不同温度和不同转化时间条件下得到阳性株数

花粉管通道法在实际操作过程中受外界环境影响较大，如温度、湿度、光照等，且月份间、年度间上述因素都会有差异。本试验考察了温度因素对结实的影响，当温度较高时，2个材料结实起始时间较早，说明通道形成早，在实际转化时要适当提前；反之，通道形成要慢些，转化要相应推迟。

在对花粉管通道形成时间段进行验证时，本试验在确定的最佳时间内(处理2)进行转化，其阳性转化率要高于处理1，说明利用去除花丝法确定花粉管通道形成时间是可行的；本试验还发现S192在3个月份间结实时间早于S173，说明其花粉管通道形成要早于S173，表明试验材料不同，通道形成时间会有差异，本试验提供的是一种确定花粉管通道打通时间的方法，最终进行花粉管通道法转化时还须因时、因地、因品种而进行适当的修正。