苹果MdMYB32通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

许海峰，杨官显，王意程，姜生辉，王楠，陈学森



苹果MdMYB32通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成

许海峰，杨官显，王意程，姜生辉，王楠，陈学森

（山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）

【目的】研究苹果MYB转录因子家族MdMYB32的生物学信息、表达水平及其在花青苷合成中的功能，旨在为进一步完善花青苷合成代谢机理提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系为试材，克隆，分析其进化树和蛋白序列；测定其在不同果实及在不同胁迫处理下的表达水平，通过转基因验证其在花青苷合成中的功能，并通过酵母单杂交分析其互作关系。【结果】qRT-PCR分析表明在花青苷含量高的‘红脆9号’苹果中表达水平较低，而在花青苷含量低的‘红脆6号’苹果中表达水平较高，与花青苷含量呈负相关；且盐胁迫和冷胁迫均能抑制的表达；在进化上，与，和在同一个进化枝上，且MdMYB32蛋白序列在C端含有一个EAR抑制序列；在红肉愈伤中过表达能够抑制的表达水平，降低花青苷含量，而过表达切除EAR抑制序列后的LES后，不能明显改变的表达水平和花青苷含量；酵母单杂交和Chip-PCR分析表明MdMYB32和LESMdMYB32均能够结合的启动子。【结论】MdMYB32能够结合启动子，并通过自身EAR抑制序列抑制花青苷的生物合成。

苹果；MYB转录因子；；EAR抑制序列；酵母单杂

0 引言

【研究意义】水果和观赏作物器官的着色是一种重要的经济特性，而花青苷通常是器官着色的重要原因，如鲜红色、红色、蓝色和紫色[1]。花青苷作为类黄酮的一种，具有抗氧化，预防心血管疾病以及抑制肥胖等功能[2-3]。MYB蛋白是植物较大的转录因子家族，在花青苷合成中发挥重要的作用。因此，研究MYB家族中在花青苷生物合成中的功能，对完善花青苷合成代谢机理具有重要意义。【前人研究进展】花青苷合成受紫外照射、低温、干旱等环境因素诱导，且涉及多种结构基因和转录因子[4-5]，前人研究表明MYB-bHLH-WD40转录复合体能够控制花青苷的合成，其中MYB家族和bHLH家族在调控花青苷合成中的作用在模式植物中得到了广泛的研究[6-7]。最近，关于水果方面花青苷合成取得了一些进展，在葡萄中，与拟南芥同源的和被发现能够调控葡萄花青苷的合成[8]，类似的同源基因在草莓、梨和桃中也被发现，分别是、和[9-10]。在苹果中，和参与了光诱导下花青苷合成[11-12]，ESPLEY等[13-14]研究发现能够调控红肉苹果中花青苷合成。笔者课题组于2006年率先构建了新疆红肉苹果与栽培苹果品种的杂种分离群体[15-20]，以此群体为试验材料，许海峰等[21]分析了杂种一代4个红肉苹果株系类黄酮和花青苷含量及相关基因的表达；JI等[22-23]探讨了氮对愈伤组织花青苷生物合成的影响，并对红色和黄色愈伤组织进行了RNA-seq分析；而WANG等[24]则对F1分离群体中的绿色和红色单株各20株进行了RNA-seq分析，筛选到了与花青苷合成相关的差异表达基因；此外，XU等[25]和WANG等[26]还分别研究了和参与花青苷合成的分子机理。【本研究切入点】EAR抑制序列的发现，为花青苷合成调控提供了新的视角。拟南芥是第一个被发现含有EAR抑制序列的负调控因子，它通过直接结合靶基因的启动子来发挥抑制其表达的作用[27-28]，草莓FaMYB1蛋白也由于存在一个类似的EAR序列，对花青苷合成具有抑制作用[29]。在苹果中，关于中EAR抑制序列对花青苷负调控研究尚未明确。【拟解决的关键问题】本研究以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆6号’为试材，克隆了含有EAR序列的，测定其在不同果实及在不同胁迫处理下的表达水平与花青素的关系，通过酵母单杂和Chip-PCR分析其互作关系，并通过转基因验证其在花青苷合成中的功能，旨在为进一步完善花青苷合成代谢机理提供参考。

1 材料与方法

试验于2017年在山东农业大学园艺科学与工程学院进行。

1.1 植物材料和处理

植物材料为从新疆红肉苹果（f.）中的‘塔尔阿尔玛’与‘烟富3号’（cv. Fuji）杂种一代选育出的‘红脆6号’‘红脆8号’和‘红脆9号’优株及‘紫红3号’苹果诱导的红肉愈伤组织（MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA培养基上培养）。红肉苹果愈伤组织诱导、培育方法参照JI等[22]。取继代生长16 d的红肉愈伤组织，分别用4℃和150mmol∙L-1NaCl处理24 h，每隔6 h取样一次，-80℃保存备用。

1.2 总RNA的提取与qRT-PCR

RNA提取及qRT-PCR参考XU等[25]方法。RNA提取试剂盒（DP432）、反转录试剂盒（KR106）、SYBR染料（FP205）均购自北京天根公司，荧光定量每个样品设3个重复，以苹果为内参，每个基因扩增均伴有内参同时扩增，默认条件下读取Ct值，采用2-ΔΔCT方法进行数据分析[30]。荧光定量引物为5′-TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT-3′和5′-TA CTCAGCTTTGGCAATCCACATC-3′，荧光定量引物为5′-CTGGAACACTCACGTCAAGC-3′，荧光定量引物为5′-GGAAACAGGTGGTC ATTGATTG-3′和5′-GGCTGAGGTCTTATCACATTG GT-3′，荧光定量引物为5′-GATAGGGTTTGA GTTCAAGTA-3′和5′-TCTCCTCAGCAGCCTCAGT TTTCT-3′，荧光定量引物为5′-GTGTCATGCA CCTTGTGAACC-3′和5′-GTAGTCCTCCCACTCAAG CTG-3′，荧光定量引物为5′-CCGCCCTTCC AAACACTCT和5′-GAGCTCTATGTCCTCCTGCG-3′。

1.3 花青苷提取和吸光度测定

花青苷提取参照JI[22]等方法，并略作改动。称取0.5 g植物材料在液氮中研磨成粉，用20 mL 1%（v/v）HCl-甲醇在4℃黑暗条件下萃取24 h，12 000 r/min离心10 min后保留上清液，用紫外分光光度计测定上清液在530 nm处吸光度，最后花青苷的相对含量用Abs/g（吸光度/质量）来表示。

1.4 overlap PCR技术敲除MdMYB32蛋白C端EAR抑制序列

参考XU等[25]方法，通过overlap PCR技术敲除MdMYB32蛋白C端EAR（GDLNLDLSIG）抑制序列。具体引物设计如下，

F1：5′-ATGGGGAGAGCACCTTGTT-3′

R1：5′-ACGGCTCTAAACACTTGTATTTCTGCT GTT-3′

F2：5′-AATACAAGTGTTTAGAGCCGTTTCAG TCCAA-3′

R2：5′-TCAACCTGGCAGCACAAA-3′

以‘红脆6号’苹果cDNA为模板，用F1和R1引物通过PCR扩增获得序列，用F2和R2引物通过PCR扩增获得序列，将扩增获得的和产物1﹕1混合，以它们为模板用F1和R2引物通过PCR扩增获得的产物即为没有EAR抑制序列的，暂命名为LES。

1.5 MdMYB32和LESMdMYB32红肉苹果愈伤组织的转化

用引物5′-gtcgacATGGGGAGAGCACCTTGT T-3′和5′-ggatccTCAACCTGGCAGCACAAA-3′扩增得到的编码框序列，用上述overlap-PCR方法扩增得到LES的编码框序列，琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，连接到PLB零背景克隆载体。用I和HI对克隆载体和植物表达载体pRI101分别进行双酶切，构建重组表达载体pRI101-和pRI101-LES。将重组质粒导入农杆菌LBA4404，在28℃下，用30 mL含50 μg·mL-1卡那霉素和50 μg·mL-1利福平的YEP液体培养基培养重组农杆菌至OD600=0.6，12 000 r/min离心收集菌体，用30 mL ddH2O悬浮，加入乙酰丁香酮并使其浓度为100 μmol·L-1，得到侵染液。取生长16 d的红肉苹果愈伤组织浸到侵染液中，室温振荡25 min，取愈伤组织置于含1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA的MS固体培养基上，28℃暗培养2 d。随后转移到含1 mg·L-16-BA+ 0.3 mg·L-1NAA+50 μg·m L-1卡那霉素+250 μg·mL-1羧苄青霉素的MS固体培养基上暗培养5周左右。

1.6 酵母单杂交

用引物5′-catatgATGGGGAGAGCACCTTGT T-3′和5′-ggatccTCAACCTGGCAGCACAAA-3′扩增的编码框序列，用引物5′-gaattcGGC TAGTTCTGTATTATGGTTGATA-3′和5′-gagctcT GATAATGTAACGTTGATTTTATAGTAG-3′扩增的启动子序列，分别连接PLB零背景载体。用I和H I对-PLB和pGADT7分别进行双酶切，用R I和I对-PLB和pHIS2分别进行双酶切，构建pGADT7-和pHIS2-重组载体。按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2试剂盒（Clontech）说明书方法，将pHIS2-重组载体转化到酵母Y187感受态细胞，细胞培养在-T-H+3-AT培养基中（-Trp/His，Clontech），筛选抑制酵母生长的3-AT浓度，然后将这两种重组质粒共转化到Y187酵母感受态细胞，细胞培养在-T-H-L+3-AT培养基中（-Trp/ His/Leu，Clontech），观察酵母生长情况。

1.7 Chip-PCR

Chip-PCR试验根据HE等[31]方法，并略作改动。按照Chip Kit（Upstate，Lake Placid，NY，USA）里说明书方法进行交联、解交联、免疫沉淀和洗脱，免疫抗体使用GFP抗体（Abmart，Shanghai，China），最后用PCR检测。PCR引物为：5′-CTGGTATGTACCATTCA CTTGTTG-3′和5′-CGATCATCCTCCGAGTGTC-3′。

1.8 数据分析

荧光定量数据用Excel 2007进行作图和标准差分析，用DPS 7.05软件（http://www.chinadps.net）进行显著性检验，用MEGA 5软件构建系统发育进化树，分析方法采用Construct/Test Neighbor-Joining Tree，用Clustal X软件分析蛋白序列。

2 结果

2.1 MdMYB32在不同苹果果实中的表达水平

图1为‘红脆6号’（HC6）‘红脆8号’（HC8）和‘红脆9号’（HC9）优株果实成熟期横截面图。由图2和图3可得，果实成熟期花青苷相对含量和花青苷合成结构基因及的相对表达水平高低顺序为‘红脆9号’>‘红脆8号’>‘红脆6号’，控制红肉苹果花青苷合成关键转录因子的相对表达水平也是‘红脆9号’>‘红脆8号’>‘红脆6号’，但的表达水平却与之相反，为‘红脆6号’>‘红脆8号’>‘红脆9号’。

2.2 MdMYB32的进化树和蛋白序列分析

如图4所示，促进花青苷合成的AtMYB75、FaMYB10、PpMYB10、MdMYB10和PyMYB10都在同一个进化枝上，抑制花青苷合成的AtMYB4、PhMYB4、MdMYB16、AtMYB32和FaMYB1在同一个进化枝上，而与等在同一个进化枝，推测其可能具有抑制花青苷合成的功能（图4中比例尺0.1代表每10个氨基酸有1个不同）。由图5可看出在MdMYB32蛋白C端存在一个10个氨基酸长度的EAR抑制序列。

图1 苹果果实成熟期横截面图

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同

2.3 冷胁迫和盐胁迫处理红肉愈伤MdMYB32的表达水平分析

由图6可知，4℃和150 mmol∙L-1NaCl处理均能抑制的表达，其中4℃低温处理后的表达水平逐渐降低，而150 mmol∙L-1NaCl处理后的表达水平先降低后又轻微回升。

图3 三个苹果株系中花青苷合成结构基因及相关转录因子相对表达水平

图4 MYB32和相关MYB蛋白系统进化树分析

图5 MYB32和相关蛋白序列分析

图6 冷胁迫（A）和盐胁迫（B）处理下MdMYB32的相对表达水平

2.4 MdMYB32和LESMdMYB32在红肉愈伤中过表达分析

红肉愈伤组织（Rc）、过表达的红肉愈伤（OEMYB32）和过表达LES（敲除EAR抑制序列的MdMYB32）的红肉愈伤（OELESMYB32）如图7所示。由图8和图9可知，在红肉愈伤中过表达能够抑制花青苷的合成和的表达，对和表达水平没有影响，但敲除MdMYB32的EAR抑制序列后，在红肉愈伤中过表达LES不能够抑制花青苷的合成，且对、和的表达水平没有影响。

Rc：红肉愈伤组织；OEMYB32：过表达MdMYB32的红肉愈伤；OELESMYB32：过表达LESMdMYB32（敲除EAR抑制序列的MdMYB32）的红肉愈伤。下同 Rc: Red-fleshed callus; OEMYB32: Overexpressing MdMYB32 in red-fleshed callus; OELESMYB32: Overexpressing LESMdMYB32 (Lost EAR inhibitory sequence of MdMYB32) in red-fleshed callus. The same as below

图8 3种愈伤花青相对苷含量

2.5 MdMYB32和LESMdMYB32与MdANS启动子的酵母单杂交和Chip-PCR分析

由图10酵母单杂交可知，pHIS2+ANS pro单转Y187后培养在-T-H培养基中，通过3-AT筛选抑制酵母生长的浓度，最后在80 mmol∙L-13-AT中酵母不能生长，因此启动子的自激活浓度为80 mmol∙L-13-AT，将pHIS2+ANS pro分别和pGADT7空载体、pGADT7+MYB32、pGADT7+LESMYB32共转Y187后培养在-T-H-L+80 mmol∙L-13-AT中，共转pHIS2+ ANS pro和pGADT7空载体的不能生长，而共转pHIS2+ANS pro和pGADT7+MYB32以及pHIS2+ ANS pro和pGADT7+LESMYB32的均能生长，因此，MdMYB32和LESMdMYB32均能结合的启动子。

HARTMANN等[32]研究表明花青苷合成结构基因启动子上的MRE（MYB recognition element）能够被MYB转录因子识别。为了进一步验证MdMYB32和LESMdMYB32与启动子的互作关系，在启动子上-1 365到-1 371处，发现了一个MRE元件，因此，选取包含MRE元件的一段序列（-1 302到-1 475）用作Chi-PCR分析。由图11可知，在Input中，GFP、MYB32-GFP和LESMYB32-GFP都有条带，而在Ip中，只有MYB32-GFP和LESMYB32-GFP有条带，因此，MYB32和LESMYB32均能结合的启动子。

3 讨论

3.1 MdMYB32能够结合MdANS启动子抑制花青苷的合成

在烟草中异源表达草莓时能抑制花青苷合成，是第一个被发现抑制花青苷合成的MYB转录因子[29]。在矮牵牛中，能够结合bHLH蛋白，作用于MBW复合体抑制花青苷的合成[33]，类似的作用模式在FaMYB1、VvMYBC2和MtMYB2中也被发现[34-36]，它们不能结合靶基因的启动子，但它们能够与bHLH蛋白结合，作用于MBW复合体从而发挥抑制作用。AtMYB4和PhMYB4与上述不同，它们能够直接结合靶基因的启动子从而发挥抑制作用[28,37]，Xu等[25]将MYB类抑制因子分为两类，一种作用于MBW复合体发挥功能，类似于FaMYB1等；另一种能直接结合靶基因启动子发挥功能，类似于AtMYB4。在本文中，发现在花青苷含量高的苹果中表达水平较低，而在花青苷含量较低的苹果中表达水平较高，这暗示着MdMYB32可能参与调控花青苷合成，且冷胁迫和盐胁迫能够抑制的表达，在红肉愈伤中过表达发现，它能够抑制的表达和花青苷的合成，进一步通过酵母单杂和Chip-PCR分析，MdMYB32能够结合的启动子，暗示着MdMYB32能直接结合花青苷合成结构基因的启动子从而抑制花青苷的合成，这与AtMYB4等类似。

图9 3种愈伤花青苷生物合成相关基因相对表达水平

图10 MdMYB32和LESMdMYB32与MdANS启动子的酵母单杂交分析

图11 MdMYB32和LESMdMYB32与MdANS启动子的Chip-PCR分析

3.2 MdMYB32通过自身C端EAR抑制序列发挥功能

EAR基序是EAR型转录抑制子的共同特征，EAR基序内氨基酸残基的变化会导致抑制功能减少或丧失[38-40]。拟南芥AtERF3通过其C末端的EAR基序能抑制AtERF5与植物中GCC box的结合，然而，当EAR基序（LDLNLAP）中D突变成A时，这种抑制功能就丧失了[39]；在拟南芥中过表达能增加盐胁迫抗性，而ZAT7蛋白的EAR基序突变或缺失降低了转基因植物中这种增加的抗性[41]；近年来，根据EAR型转录抑制子的结构和功能，开发了一种嵌合抑制基因沉默技术，将EAR基序添加到活化剂的C末端作为嵌合蛋白融合，通过转基因导入植物来实现定性功能缺失[42-43]。本研究通过overlap PCR技术敲除MdMYB32蛋白C端的EAR基序（GDLNLDLSIG），暂命名为LESMdMYB32，酵母单杂交和Chip-PCR实验表明MdMYB32和LESMdMYB32都能够结合的启动子，说明EAR序列的存在与否不影响MdMYB32与启动子的结合，然而在红肉愈伤中过表达LES后，发现它不能够抑制花青苷的合成，因此，MdMYB32通过自身的EAR抑制基序来发挥功能。

4 结论

本研究发现MdMYB32蛋白C端存在一个EAR抑制序列，盐胁迫和冷胁迫均能够抑制其表达，酵母单杂和Chip-PCR分析表明MdMYB32能够结合的启动子。在红肉愈伤中过表达，能通过自身的EAR抑制基序抑制花青苷的合成。

[1] 张学英, 张上隆, 骆军, 叶正文, 李世诚. 果实花色素苷合成研究进展. 果树学报, 2004, 21(5): 456-460.ZHANG X Y, ZHANG S L, LUO J, YE Z W, LI S C. Advances in research on fruit anthocyanin synthesis., 2004, 21(5): 456-460. (in Chinese)

[2] ZHANG W S, LI X, ZHENG J T, WANG G Y, SUN C D, FERGUSON I B, CHEN K S. Bioactive components and antioxidant capacity of Chinese bayberry（Sieb. and Zucc.）fruit in relation to fruit maturity and postharvest storage., 2008, 227(4): 1091-1097.

[3] SUN C D, HUANG H Z, XU C J, LI X, CHEN K S. Biological activities of extracts from Chinese bayberry (Sieb. et Zucc.): A review., 2013, 68(2): 97-106.

[4] KOES R, VERWEIJ W, QUATTROCCHIO F. Flavonoids, a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways., 2005, 10: 236-242.

[5] BAI S L, SAITO A, HONDA C, HATSUYAMA Y, ITO A, MORIGUCHI T. An apple B-box protein, MdCOL11, is involved in UV-Band temperature-induced anthocyanin biosynthesis., 2014, 240: 1051-1062.

[6] BALLESTER A R, MOLTHOFF J, DE VOS R, TE LINTEL H B, ORZAEZ D, FERNANDEZMORENO J P, TRIPODI P, GRANDILLO S, MARTIN C, HELDENS J, YKEMA M, GRANELL A, BOVY A. Biochemical molecular analysis of pink tomatoes, deregulated expression of the gene encoding transcription factor SlMYB12 leads to pink tomato fruit color., 2010, 152: 71-84.

[7] ALBERT N W, LEWIS D H, ZHANG H, SCHWINN K E, JAMESON P E, DAVIES K M. Members of an R2R3-MYB transcription factor family in Petunia are developmentally and environmentally regulated to control complex floral and vegetative pigmentation patterning., 2011, 65: 771-784.

[8] AZUMA A, KOBAYASHI S, MITANI N, SHIRAISHI M, YAMADA M, UENO T, KONO A, YAKUSHIJI H, KOSHITA Y. Genomic and genetic analysis of Myb-related genes that regulate anthocyanin biosynthesis in grape berry skin., 2008, 117: 1009-1019.

[9] WANG L K, BOLITHO K, GRAFTON K, KORTSTEE A, KARUNAIRETNAM S, MCGHIE T K, ESPLEY R V, HELLENS R P, ALLAN A C. An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae., 2010, 10: 50.

[10] FENG S Q, WANG Y L, SONG Y, XU Y T, CHEN X S. Anthocyanin biosynthesis in pears is regulated by a R2R3-MYB transcription factor PyMYB10., 2010, 232: 245-255.

[11] TAKOS A M, JAFFÉ F W, JACOB S R, BOGS J, ROBINSON S P, WALKER A R. Light-induced expression of a MYB gene regulates anthocyanin biosynthesis in red apples., 2006, 142(3): 1216-1232.

[12] BAN Y, HONDA C, HATSUYAMA Y, IGARASHI M, BESSHO H, MORIGUCHI T. Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin., 2007, 48: 958-970.

[13] ESPLEY R V, HELLENS R P, PUTTERILL J, STEVENSON D E, KUTTY-AMMA S, ALLAN A C. Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor MdMYB10., 2007, 49: 414-427.

[14] ESPLEY R V, BRENDOLISE C, CHAGNÉ D, KUTTY-AMMA S, GREEN S, VOLZ R, PUTTERILL J, SCHOUTEN H J, GARDINER S E, HELLENS R P, ALLAN A C. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples., 2009, 21: 168-183.

[15] 张小燕, 陈学森, 彭勇, 王海波, 石俊, 张红. 新疆野苹果酚类物质组分的遗传多样性. 园艺学报, 2008, 35(9): 1351-1356.ZHANG X Y, CHEN X S, PENG Y, WANG H B, SHI J, ZHANG H. Genetic diversity of phenolic compounds in., 2008, 35(9): 1351-1356. (in Chinese)

[16] 张小燕, 陈学森, 彭勇, 王海波, 石俊, 张红. 新疆野苹果矿质元素与糖酸组分的遗传多样性. 园艺学报, 2008, 35(2): 277-280.ZHANG X Y, CHEN X S, PENG Y, WANG H B, SHI J, ZHANG H. Genetic diversity of mineral elements, sugar and acid components in(Ldb.) Roem., 2008, 35(2): 277-280. (in Chinese)

[17] ZHANG C Y, CHEN X S, HE T M, LIU X L, FENG T, YUAN Z H. Genetic structure ofpopulation from Xinjiang, China, revealed by SSR markers., 2007, 34(10): 947-955.

[18] 张艳敏, 冯涛, 张春雨, 何天明, 张小燕, 吴传金, 刘遵春, 王艳玲, 束怀瑞, 陈学森. 新疆野苹果研究进展. 园艺学报, 2009, 36(3): 447-452.ZHANG Y M, FENG T, ZHANG C Y, HE T M, ZHANG X Y, WU C J, LIU Z C, WANG Y L, SHU H R, CHEN X S. Advances in research of the(Lebed.) Roem., 2009, 36(3): 447-452. (in Chinese)

[19] 冯涛, 张红, 陈学森, 张艳敏, 何天明, 冯建荣, 许正. 新疆野苹果果实形态与矿质元素含量多样性以及特异性状单株. 植物遗传资源学报, 2006, 7(3): 270-276.FENG T, ZHANG H, CHEN X S, ZHANG Y M, HE T M, FENG J R, XU Z. Genetic diversity of fruit morphological traits and content of mineral element in(Ldb.) Roem and its elite seedlings., 2006, 7(3): 270-276. (in Chinese)

[20] 王延玲, 张艳敏, 冯守千, 宋杨, 徐玉亭, 张友朋, 陈学森. 新疆红肉苹果果皮果肉呈色差异机理. 中国农业科学, 2012, 45(13): 2771-2778.WANG Y L, ZHANG Y M, FENG S Q, SONG Y, XU Y T, ZHANG Y P, CHEN X S. The mechanism of red coloring difference between skin and cortexf.(Dieck) Langenf., 2012, 45(13): 2771-2778. (in Chinese)

[21] 许海峰, 王楠, 姜生辉, 王意程, 刘静轩, 曲常志, 王得云, 左卫芳, 张晶, 冀晓昊, 张宗营, 毛志泉，陈学森. 新疆红肉苹果杂种一代4个株系类黄酮含量及其合成相关基因表达分析. 中国农业科学, 2016, 49(16): 3174-3187.XU H F, WANG N, JIANG S H, WANG Y C, LIU J X, QU C Z, WANG D Y, ZUO W F, ZHANG J, JI X H, ZHANG Z Y, MAO Z Q, CHEN X S. Content and analysis of biosynthesis-related genes of flavonoid among four strains off.F1population., 2016, 49(16): 3174-3187. (in Chinese)

[22] JI X H , WANG Y T , ZHANG R, WU S J , AN M M, LI M, WANG C Z , CHEN X L , ZHANG Y M , CHEN X S. Effect of auxin, cytokinin and nitrogen on anthocyanin biosynthesis in callus cultures of red-fleshed apple (f.)., 2015, 120: 325-337.

[23] JI X H, ZHANG R, WANG N, YANG L, CHEN X S. Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus (f.)., 2015, 123: 389-404.

[24] WANG N, ZHENG Y, DUAN N B, ZHANG Z Y, JI X H, JIANG S H, SUN S S, YANG L, BAI Y, FEI Z J, CHEN X S.Comparative transcriptomes analysis of red and white-fleshed apples in an F1populationoff.crossed with‘Fuji’., 2015. Doi:10.1371/journal.pone. 0133468, 2015.

[25] XU H F, WANG N, LIU J X, QU C Z, WANG Y C, JIANG S H, LU N L, WANG D Y, ZHANG Z Y, CHEN X S. The molecular mechanism underlying anthocyanin metabolism in apple using theandgenes., 2017, 94: 149-165.

[26] WANG N, XU H F, JIANG S H, ZHANG Z Y, LU N L, QIU H R, QY C Z, WANG Y C, WU S J, CHEN X S. MYB12 and MYB22 play essential roles in proanthocyanidin and flavonol synthesis in red-fleshed apple (f.)., 2017, 90: 276-292.

[27] JIN H L, COMINELLI E, BAILEY P, PARR A, MEHRTENS F, JONES J, TONELLI C. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in., 2000, 19: 6150-6161.

[28] HEMM M R, HERRMANN K M, CHAPPLE C. AtMYB4: A transcription factor general in the battle against UV., 2001, 6(4): 135-136.

[29] AHARONI A, DE VOS C, WEIN M, SUN Z, GRECO R, KROON A, MOL J N, O’CONNELL A P. The strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco., 2001, 28(3): 319-332.

[30] KENNETH J L, THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod., 2001, 25: 402-408.

[31] HE J X, GENDRON J M, SUN Y, GAMPALA S S L, GENDRON N, SUN C Q, WANG Z. BZR1 is a transcriptional repressor with dual roles in brassinosteroid homeostasis and growth responses., 2005, 307: 1634-1638.

[32] HARTMANN U, SAGASSER M, MEHRTENS F, STRACKE R, WEISSHAAR B. Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by R2R3-MYB，BZIP，and BHLH factors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes., 2005, 57(2): 155-171.

[33] ALBERT N W, DAVIES K M, LEWIS D H, ZHANG H, MONTEFIORI M, BRENDOLIS C, BOASE M R, NGO H, JAMESON P E, SCHWINN K E. A conserved network of transcriptional activators and repressors regulates anthocyanin pigmentation in eudicots., 2014, 26: 962-980.

[34] PAOLOCCI F, ROBBINS M P, PASSERI V, HAUCK B, MORRIS P, RUBINI A, ARCIONI S, DAMIANI F. The strawberry transcription factor FaMYB1 inhibits the biosynthesis of proanthocyanidins in Lotus corniculatus leaves., 2011, 62(3): 1189-1200.

[35] JUN J Y, LIU C G, XIAO X R, DIXON R A. The Transcriptional repressor MYB2 regulates both spatial and temporal patterns of proanthocyandin and anthocyanin pigmentation in., 2015. doi:10.1105/tpc.15.00476.

[36] CAVALLINI E, MATUS J T, FINEZZO L, ZENONI S, LOYOLA R, GUZZO F, SCHLECHTER R, AGEORGES A, ARCE-JOHNSON P, TORNIELLI G B. The phenylpropanoid pathway is controlled at different branches by a set of R2R3-MYB C2 repressors in grapevine., 2015, 167: 1448-1470.

[37] COLQUHOUN T A, KIM J Y, WEDDE A E, LEVIN L A, SCHMITT K C, SCHUURINK R C, CLARK D G. PhMYB4 fine-tunes the floral volatile signature of×through PhC4H., 2011, 62: 1133-1143.

[38] OHTA M, MATSUI K, SHINSHI H, OHME-TAKAGI M. Repression domains of class II ERF transcriptional repressors share an essential motif for active repression., 2001, 13: 1959-1968.

[39] TIWARI S B, WANG X J, HAGEN G, GUILFOYLE T J. Aux/IAA proteins are active repressors and their stability and activity are modulated by auxin., 2001, 13: 2809-2822.

[40] TIWARI S B, HAGEN G, GUILFOYLE T J. Aux/IAA proteins contain a potent transcriptional repression domain., 2004, 16: 533-543.

[41] CIFTCI-YILMAZ S, MORSY M R, SONG L H, COUTU A, KRIZEK B A, LEWIS M W, WARREN D, CUSHMAN J, CONNOLLY E L, MITTLER R. The EAR-motif of the Cys2/His2-type zinc finger protein Zat7 plays a key role in the defense response ofto salinity stress., 2007, 282: 9260-9268.

[42] MITSUDA N, TODAKA D, NAKASHIMA K, YAMAGUCHI- SHINOZAKI K, OHME-TAKAGI M. Efficient production of male and female sterile plants by expression of a chimeric repressor inand rice., 2006, 4: 325-332.

[43] KAM J, GRESSHOFF P M, SHORTER R, XUE G P. The Q-type C2H2 zinc finger subfamily of transcription factors inis predominantly expressed in roots and enriched with members containing an EAR repressor motif and responsive to drought stress., 2008, 67(3): 305-322.

Apple MdMYB32 Inhibits the Anthocyanin Biosynthesis by Its Own EAR Inhibitory Sequence

XU HaiFeng, YANG GuanXian, WANG YiCheng, JIANG ShengHui, WANG Nan, CHEN XueSen

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology,Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】In order to improve the metabolic mechanism of anthocyanin synthesis, several aspects of apple MdMYB32 in MYB transcription factors were studied, including the bio-informatics, the expression level and the function in the anthocyanin synthesis.【Method】 We cloned thef.F1 population and analyzed its phylogenetic tree and protein sequence. The expression level of【Result】qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwas negatively correlated with the content of anthocyanin. Both salt stress and cold stress could inhibit the expression of. The phylogenetic tree indicated that,,andwere located in the same evolutionary branch, and MdMYB32 protein contained an EAR inhibitory sequence at the C-terminus. Overexpressingand reduce the anthocyanin content. However, when we overexpressed LES(knocked out the EAR sequence of) in red-fleshed callus, we found that it could not affect the expression ofand the anthocyanin content. Yeast one-hybrid and Chip-PCR analyses showed that MdMYB32 and LESMdMYB32 could bind the promoter of.【Conclusion】MdMYB32 could bind the promoter ofand inhibit the anthocyanin biosynthesis by its own EAR inhibitory sequence.

apple; MYB transcription factors;; EAR inhibitory sequence; yeast one-hybrid

2018-06-22；

2018-07-16

国家自然科学基金（31572091，31730080）、国家重点研发计划（SQ2016YFSF030011）

许海峰，E-mail：997524744@qq.com。

陈学森，E-mail：chenxs@sdau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.24.009

（责任编辑 赵伶俐）