FBXW7在糖尿病心肌病中的表达*

申屠路媚， 卢 敏， 王 燕， 牟艳玲△

(1济南大学-山东省医学科学院医学与生命科学学院， 山东 济南 250200； 2山东省医学科学院药物研究所， 国家卫生部生物技术药物重点实验室， 山东省罕少见病重点实验室， 山东 济南 250062)

随着人们生活水平的提高以及肥胖发生率的增加，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，心血管并发症是DM患者死亡的主要原因，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是DM心血管并发症中一种独立、特异的心肌病，与糖尿病患者发生心力衰竭和死亡率升高密切相关[1]。

含F框/WD重复域蛋白7(F-box/WD repeat-containing protein 7，FBXW7)是F-box蛋白家族成员，为 Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素连接酶体系的靶蛋白识别组分[2]。FBXW7作为一种肿瘤抑制基因，可通过介导泛素蛋白酶体途径降解多种癌蛋白，如cyclin E、c-Myc、mTOR、Notch1和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)等，在细胞周期进程、细胞生长、分化、凋亡、肿瘤转移及肿瘤抗药性等多个方面发挥重要的调控作用[3-5]。研究表明，mTOR[6]、Notch[7]及RhoA[8]等均可参与糖尿病心肌病的发生发展。此外还有研究[9-11]发现，FBXW7通过调节内皮细胞迁移，促进血管生成，在一定程度上起到减轻冠心病的作用，但FBXW7对DCM发生发展的作用尚未见报道。本文通过Western blot和免疫组化方法检测FBXW7在DCM中的表达情况，初步探讨FBXW7在DCM发生发展过程中的表达变化，为糖尿病心肌病的防治寻找新的靶点。

材 料 和 方 法

1 实验动物

健康雄性 SD大鼠72只，SPF级，体重 180～200 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号为SCXK(鲁)2014-0007。

2 材料与试剂

链脲佐菌素和戊巴比妥钠(Sigma)；血糖试纸(强生中国医疗器材有限公司)；SABC免疫组化染色试剂盒(SA1020，武汉博士德生物技术有限公司)；浓缩型 DAB试剂盒和II抗辣根酶标记山羊抗兔抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot 细胞裂解液、Western blot实验用的I 抗、II抗稀释液、Western blot转膜液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购自碧云天生物技术研究所；Pro-Sieve Color protein markers (Lonza)；PVDF膜(0.45 μm，SERVA)；ECL化学发光试剂(Millipore)；抗FBXW7抗体(Abcam)；抗β-actin抗体(Cell Signaling Technology)。

3 仪器

DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)；Wallac 1420 型多标记酶标仪(Perkin Elmer)；RM2235型石蜡包埋机和EG1150型切片机(Leica)；J-25 型高速冷冻离心机(Beckman)；LAS4000 型化学发光成像仪(Fujifilm)；Eclipse TE2000-S 型免疫荧光显微镜(Nikon)。

4 方法

4.1糖尿病大鼠模型的建立 健康雄性 SD大鼠适应性喂养1周后，按体重均衡的原则随机分为非糖尿病组(non-diabetic，ND组)30只和糖尿病模型组(DM组)42只。造模前禁食16 h，DM组大鼠一次性腹腔注射1% 链脲佐菌素(60 mg/kg， 用pH4.4柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液于4 ℃配制，现配现用)，ND组正常大鼠注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。72 h 后尾静脉采血检测空腹血糖 (fasting blood glucose，FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L为DM模型成功，本次造模成功38只。再将ND组正常大鼠随机分为4、8 和 12 周空白对照组，每组10只；DM组造模成功大鼠随机分为4、8和12周模型组(4W-DM、 8W-DM和12W-DM组)，每组分别为12只、13只和13只。

4.2标本收集 大鼠麻醉，开胸，迅速取出心脏，用预冷生理盐水洗净，剔除血管和脂肪等非心肌组织，滤纸吸干水分后称心脏重量和左心室(含室间隔)重量，并计算心脏(左心室)指数=心脏(左心室)重量(mg)/体重(g)。分离的左心室再分为2部分：一部分用福尔马林固定，经脱水、透明、包埋，制成心肌组织石蜡块；另一部分置于EP管，于液氮中保存待用。

4.3HE染色 取石蜡切片常规脱蜡至水，苏木精染色10 min，流水稍洗，体积分数为0.01的盐酸乙醇分化，流水冲洗数分钟，伊红染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察心肌组织病理结构的改变。

4.4Western blot实验 每20 mg心肌组织中加入100～200 μL含1 mmol/L PMSF的裂解液，制备组织匀浆，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取匀浆上清，BCA 法测定总蛋白浓度。每孔40～60 μg 总蛋白上样量以浓度为8%的凝胶电泳进行分离，冰浴下恒流(300 mA)湿法转膜2 h，质量分数为5% 的脱脂奶粉室温封闭1.5 h后，与相应 I 抗4 ℃共孵育过夜，抗体稀释比例分别为1∶800(FBXW7)和1∶1 000(β-actin)；次日TBS-T洗液(pH 7.6)洗涤后，与辣根酶标记的II 抗共孵育3 h，用ECL化学发光试剂进行显色，并利用ImageJ2x灰度分析软件定量分析，以 β-actin 的灰度值标化蛋白表达。

4.5免疫组化染色 取石蜡切片常规脱蜡至水，磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)洗涤，浸入体积分数为0.03 的过氧化氢封闭液中，室温封闭30 min，以阻断内源性过氧化物酶。枸橼酸缓冲液(0.01 mol/L，pH 6.0)高压3 min以修复抗原，自然冷却至室温。PBS 洗涤后滴加 I 抗，4 ℃湿盒过夜，抗体稀释比例为FBXW7 (1∶800)。次日切片恢复至室温后，分别滴加 II 抗和辣根酶标记工作液，37 ℃温箱分别孵育 20 min。PBS洗涤后DAB显色，苏木精轻度复染，自来水水洗返蓝，梯度乙醇常规脱水，中性树胶封片，于显微镜下观察结果。每组随机取 10个视野，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定平均积分吸光度。

5 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，所有数据均以均数±标准差(mean±SD) 表示，各项指标组间差异比较采用单因素方差分析及Boferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠模型建立情况

实验期间，ND组大鼠一般状态良好、健壮、皮毛有光泽，自主活动正常，对外界反应灵敏，无死亡。与ND组比较，DM组大鼠逐渐出现多饮[(63.6±5.2)vs(282.2±65.5) mL/24 h]、多食[(24.7±1.9)vs(52.1±9.4) g/24 h]、多尿[(3.7±1.3)vs(224.3±42.8) mL/24 h]和消瘦，精神萎靡，皮毛无光泽，腥臊酮臭味加重，且随着时间延长，多饮、多食、多尿和消瘦表现加重，大鼠生存状态越来越差，造模成功38只，成功率为90%。

2 大鼠体重及心脏各指标的测定结果

在4、 8和12周时，ND组大鼠体重明显增加，FBG正常；与ND组相比，DM组大鼠体重明显降低(P<0.01)，FBG明显升高(P<0.01)。此外，DM组大鼠心脏及左心室重量均比ND组明显降低(P<0.01)，但心脏指数和左心室指数均显著高于ND组(P<0.01)，见表1。

表1 糖尿病大鼠的一般特征

BW: body weight; HW: heart weight; LVW: left ventricular weight; HWI: HW/BW; LVWI: LVW/BW; FBG: fasting blood glucose. These indexes were evaluated and calculated at the end of the protocol time.**P<0.01vsND group.

3 大鼠心肌组织病理观察结果

ND组大鼠心肌纹理清晰，心肌细胞排列整齐，细胞核均匀分布，无变性、坏死等病理结构改变。DM 组大鼠均观察到不同程度的病变，4周DM组心肌细胞胞浆丰富，细胞核形状不规则，排列紊乱，可见个别心肌细胞坏死；8周DM组局部大量心肌细胞坏死，坏死心肌细胞胞浆红染；12周DM组可见心肌细胞肥大且局部不同程度凝固性变性、坏死，胞浆嗜酸性增强，核固缩深染，见图1。

Figure 1.The pathological structural changes of the cardiac myocardium (HE staining, ×200).

4 FBXW7在大鼠心肌中的表达

Western blot 实验结果表明，DM组大鼠相对于ND组心肌组织中FBXW7 的表达显著增加(P<0.01)，且8周DM组表达量明显高于4周DM组(P<0.01)，维持在较高水平；12周DM组表达显著低于8周DM组(P<0.01)，但仍高于ND组(P<0.01),见图2。

Figure 2. The myocardial expression levels of FBXW7 in diffe-rent groups tested by Western blot. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs ND group; ##P<0.01 vs 4W-DM group; △△P<0.01 vs 8W-DM group.

免疫组化观察结果显示，FBXW7在心肌细胞中主要表达于细胞核，少量在细胞质中表达。FBXW7在各组中的表达量趋势与Western blot 实验结果一致：4周和8周DM组表达量显著高于ND组(P<0.01)，且8周DM组表达量高于4周DM组(P<0.05)；12周DM组表达量相对于8周DM组显著减少(P<0.01)，但仍明显高于ND组(P<0.05)，见图3。

讨 论

DCM的始动因素是心肌能量代谢异常，包括糖和乳酸盐代谢减少，脂肪代谢增加，从而导致游离脂肪酸的堆积，在此基础上出现氧化应激、线粒体损伤，进而导致细胞凋亡、炎症反应增加和心肌纤维化等病理改变，同时出现心肌结构和功能的改变[12-13]。本研究中，DM组大鼠FBG明显升高，体重明显低于ND组；4、8和12周DM组大鼠心脏及左心室重量均明显降低，但心脏指数和左心室指数均明显高于ND组，表明DM组大鼠可能出现心肌肥大。随着研究时期的延长，DM组大鼠心肌出现局部变性甚至坏死，表明DM组大鼠心肌出现了不同程度时间依赖性的心肌损伤以及DCM模型的成功。

Figure 3.The myocardial expression of FBXW7 in different groups tested by immunohistochemistry (×400). Positive expression was visualized by brown staining. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs ND group; #P<0.05 vs 4W-DM group; △△ P<0.01 vs 8W-DM group.

FBXW7作为近年来发现的一种重要的抑癌基因，在人体细胞周期的进程、细胞的生长和分化起重要的调节作用，其缺失能引起和加快癌细胞增殖。Matsuoka等[14]发现 FBXW7是造血系统重要的防御因子，其缺失会导致造血系统细胞不成熟和急性淋巴细胞白血病的发生；Yokobori等[15]发现p53控制FBXW7的转录，从而导致FBXW7在胃癌组织中的表达降低，不良预后增加；Iwatsuki等[16]发现大肠癌组织中 FBXW7的表达明显低于相应正常组织，FBXW7表达低提示预后不良。越来越多的研究显示，FBXW7可通过参与各种信号通路对恶性肿瘤的发生发展起调控作用。Li 等[17]运用Pearson相关系数分析表明FBXW7在胃癌组织中的表达与RhoA蛋白表达呈负相关关系，且FBXW7 通过调控泛素蛋白酶体的降解来调节RhoA水平，说明胃癌中 FBXW7 通过 RhoA信号通路来调节肿瘤细胞凋亡、生长停滞和上皮间质转化。有研究[18]发现Polo样激酶2(Plk2)通过靶向结直肠癌中的FBXW7/细胞周期蛋白E途径来调节肿瘤生长和凋亡，通过恢复FBXW7表达和细胞周期蛋白E的消耗，Plk2的促肿瘤活性可以被反转。涂康生等[19]证实FBXW7是一个肝细胞癌的抑癌基因，且其通过泛素化蛋白酶解下调YAP蛋白表达来诱导肝癌细胞凋亡和生长停滞，因此FBXW7可以通过Hippo-YAP信号通路发挥抑癌功能。

另有相关研究表明FBXW7与冠心病的发生具有相关性。Onoyama等[20]研究结果显示，FBXW7调节小鼠肝脏脂质代谢和脂肪细胞分化；还有研究[21]发现，FBXW7通过针对性降解C/EBPα，从而控制脂肪细胞分化。因此，FBXW7可能是一个重要的调节能量和脂质代谢的蛋白，提示FBXW7可能与冠心病有关。FBXW7还能通过调节内皮细胞迁移，促进血管生成，可以在一定程度上起到减轻冠心病的作用[9-11]。我们通过Western blot和免疫组化实验检测了FBXW7在DCM中的表达情况，研究结果显示FBXW7在大鼠心肌中主要表达于细胞核，少量在细胞质中表达；各糖尿病模型组大鼠相对于正常对照组心肌组织中FBXW7 的表达量显著增加，且8周 DM组表达量明显高于4周 DM组，维持在较高水平，12周DM组表达增加量减少，明显低于8周DM组。FBXW7在4周、8周和12周DM组大鼠心肌组织中的表达变化趋势，我们猜测可能是由机体代偿反应引起的，但是，FBXW7在糖尿病心肌病发生发展过程中的具体作用还需进一步研究。

糖尿病心肌病是糖尿病性心脏病的特异性病变，是糖尿病心血管严重并发症的重要组成部分。本实验揭示了FBXW7在糖尿病心肌病中有表达且随病程延长其表达呈一定变化趋势， 下一步我们将深入研究其在糖尿病心肌病中的作用并阐明其机制，以期为糖尿病心肌病的治疗提供新的理论依据。