20-HETE作用受体的发现及其对高血压的影响*

毛 凌， 贾蝉忆， 贺 滟， 韩 勇

(遵义医学院基础医学院生理教研室， 贵州 遵义 563000)

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)可通过环氧合酶和脂氧合酶代谢途径生成白三烯类、前列腺素类和血栓素类等物质[1]。近年研究发现，AA经过细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)代谢途径中的表氧化酶作用可生成环氧二十碳四烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)，经过羟化酶作用生成羟基二十碳四烯酸(hydroxyeicosatetraeonic acids, HETEs)，如20-羟基二十碳四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid，20-HETE)。20-HETE作为AA的重要代谢产物，与高血压、脑卒中、心肌梗死、血管痉挛和血管再狭窄等疾病密切相关[2-4]。近年来研究发现20-HETE的结构类似物可阻断或模拟20-HETE所诱导的缩血管效应[5]，提示在细胞中存在一种特异性结合位点来调节20-HETE的作用，但由于20-HETE比其它脂类活性物质具有更大的脂溶性特性，会被细胞迅速摄取并由膜磷脂所酯化，因此探究20-HETE是否与细胞膜绑定的G蛋白或其它类型受体结合进而发挥生理作用的研究进展缓慢。

最近，Garcia等[6]学者通过点击化学交联、伴侣蛋白分析和受体结合分析等研究方法首次发现，20-HETE可通过G蛋白偶联受体75(G-protein-coupled receptor 75, GPR75)影响血管功能并引发高血压。GPR75属于G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCRs)家族中视紫红质样受体，被学者列为孤儿GPCRs[7]，并进行了多项研究以确定其配体。在一项研究中发现，在胰岛β细胞中表达GPR75并通过CC类趋化因子配体5(C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)刺激胰岛素合成，但是该研究并未鉴定CCL5和GPR75之间的直接结合或相互作用[8]。20-HETE-GPR75功能联系的发现，对于揭示20-HETE生物学作用相关分子机制研究具有重要意义。

1 20-HETE作用受体的研究

有学者首先发现20-HETE的一些特异性的结构类似物或拮抗剂可模拟或阻断其生物作用，提示细胞中存在与20-HETE特异性结合的位点[5]。进一步的研究发现，20-HETE可通过磷脂酶C(phospholipase C, PLC)/蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途径依赖机制发挥血管收缩效应及钠尿排泄作用，由其诱发的细胞迁移和增殖以及内皮功能紊乱和炎症反应的作用与表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)磷酸化、c-Src和促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路激活密切相关[9]，而EGFR、c-Src和MAPK信号通路是GPCRs的下游作用靶点。此外，有研究发现在肾脏上皮细胞中，20-HETE可通过EGFR和c-Src依赖机制激活Raf/MEK/ERK途径[10]。这些研究进一步提示细胞内可能存在通过c-Src介导的20-HETE特异性GPCRs-EGFR的转激活现象，即非配体依赖途径激活GPCRs。但20-HETE化学性质很不稳定，作为脂质类物质可直接透膜进入细胞，并被迅速酯化为磷脂或与相应膜蛋白结合，从而在细胞内进行分布，这为鉴定20-HETE在细胞内的绑定效应物提出了较高要求。Garcia等[6]应用了具有光敏特性的20-HETE类似物(20-ApheDa)，利用点击化学方法将20-HETE类似物附着荧光标签，并使之分布到细胞表面附近，随后通过被标记的20-HETE类似物，利用蛋白组学等技术鉴定出与之结合的配体，最终发现20-HETE类似物结合的膜蛋白——GPR75蛋白。由于20-HETE在高血压、脑卒中、心肌梗死、血管壁肥厚、肾缺血/再灌注损伤、血管再生、细胞增殖和肿瘤等疾病的发病机制中起关键作用[11]，GPR75的鉴定是深入探究20-HETE在心血管疾病中作用机制的重要发现，为其它脂类活性物质受体的发现提供新方法，为研制治疗心血管疾病药物提供新的靶向目标和新的思路。

2 20-HETE-GPR75与血管内皮细胞功能紊乱

血管内皮功能紊乱是高血压等心血管疾病、免疫系统疾病、糖尿病以及肿瘤性疾病的诱发因素，内皮功能障碍主要诱因与NO的生物利用度降低密切相关[12-13]。虽然血管内皮细胞不是20-HETE生成的主要部位，但研究表明20-HETE通过与NO的相互作用，在调节血管内皮细胞功能方面发挥重要作用[14],一方面，在NO的非cGMP依赖作用途径中，NO可与CYP ω-羟化酶家族CYP1B、CYP2C和CYP4A结合，通过减少20-HETE合成，从而降低对大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的抑制效应，有效减弱20-HETE介导的血管收缩效应[15];另一方面，20-HETE可通过核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路介导，引起内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)解偶联而阻碍NO生成，导致其生物利用率降低[16]。20-HETE所引起的内皮功能紊乱在高血压相关的疾病中发挥重要作用，最近一项研究发现，20-HETE通过增强嗜中性粒细胞浸润作用而诱发内皮功能障碍和凋亡，加重代谢综合征大鼠的高血压发展[17]。

Garcia等[6]报道，20-HETE通过降低NO利用率促进血管内皮细胞功能紊乱与GPR75受体的激活密切相关。在该项研究中发现，20-HETE首先与血管内皮细胞膜表面的GPR75绑定，进而激活该受体，活化的GPR75一方面与其绑定单位Gαq/11解离，分离的Gαq/11激活PLC，活化的PLC进而水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate, PIP2)生成肌醇三磷酸(inositol trisphosphate, IP3)和二酰甘油(diacylglycerol, DAG)，而IP3具有促使PKC的磷酸化、激活和易位等作用[18];另一方面，GPR75被激活后促进与其结合的GPCR激酶2相互作用蛋白1(GPCR kinase 2-interacting protein 1, GIT1)释放c-Src，c-Src与EGFR结合并使之磷酸化，后者通过激活NF-κB信号通路最终引发内皮eNOS的解聚、血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)的表达，ACE激活肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)导致血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)升高，Ang II有促进内皮素生成、刺激超氧负离子生成的功能，进一步干扰NO的生成及生物利用度，达到收缩血管的作用，最终导致血管内皮功能紊乱[19]。总之，如上研究表明GPR75-20-HETE是引起血管内皮细胞功能紊乱，进而诱发血管炎症、损伤以及高血压等疾病的关键环节。20-HETE-GPR75诱发内皮细胞功能紊乱的信号转导途径见图1。

3 20-HETE-GPR75调节血管平滑肌细胞功能

大量研究证实，20-HETE具有强效的收缩血管平滑肌的作用，通过对血管紧张度的调节引起外周血管收缩，从而参与高血压的发生和发展[4, 11]。目前研究认为其作用机制主要包括：(1)20-HETE通过抑制平滑肌细胞膜上BKCa的开放减少K+外流，细胞膜发生去极化，激活电压门控L型Ca2+通道，导致细胞内Ca2+浓度升高,触发兴奋-收缩偶联，使血管平滑肌细胞产生收缩；(2)直接作用于细胞膜L型Ca2+通道增加Ca2+内流，提高细胞内的Ca2+浓度；(3)激活Rho相关激酶(Rho-associated kinase, ROCK)增加平滑肌细胞对Ca2+敏感性。

在培养的大鼠主动脉平滑肌细胞中，Garcia等[6]同样鉴定出20-HETE与GPR75的绑定，通过GPR75介导20-HETE对血管紧张度的调节作用。20-HETE首先与平滑肌细胞膜表面GPR75结合并使其激活，活化的GPR75与Gαq/11亚单位解离，Gαq/11通过激活PLC生成IP3，IP3通过PKC的磷酸化途径以及内质网IP3受体通道增加细胞内的Ca2+水平从而引发血管收缩。该研究还发现，GPR75-20-HETE可通过平滑肌细胞中PKCα激活和c-Src释放机制磷酸化BKCa的β亚单位从而抑制该通道，降低平滑肌细胞膜电位使L型Ca2+通道激活，诱发细胞内Ca2+浓度升高。此外，20-HETE通过GPR75激活细胞内的PKC磷酸化，除引起细胞内Ca2+浓度升高增强平滑肌细胞收缩，还可激活ROCK信号通路，通过ROCK磷酸化增加肌球蛋白轻链磷酸化作用，提高平滑肌细胞对Ca2+敏感性，促进平滑肌细胞收缩[20]。20-HETE-GPR75促进平滑肌细胞收缩的信号转导途径见图2。

4 20-HETE对高血压的影响及GPR75的作用

大量动物及人体研究实验表明，在不同类型的高血压中20-HETE的含量发生改变，减少20-HETE生成或阻断其作用可起到有效降低血压的作用[4, 11]。如在自发高血压模型大鼠中，抑制CYP4A、减少20-HETE生成可降低血管炎症、氧化应激反应以及改善血管的舒缩功能[21]；在高盐诱导大鼠高血压中，阻断20-HETE生成可降低高盐诱导的血压升高作用[22]；在过表达人CYP4A11的转基因小鼠中，肾脏及尿液中20-HETE生成增加，同时伴有血压升高，而低盐饮食以及抑制20-HETE合成可有效降低血压[23]。最近的研究发现，20-HETE水平增高参与了雄激素诱导的高血压发展，抑制CYP4A2及20-HETE作用可有效降低雄激素诱导的血压升高，介导绝经后妇女及多囊卵巢综合征患者高血压进程，该种类型高血压也被学者称为雄激素诱导20-HETE依赖性高血压[24]。此外，20-HETE与RAS在高血压发病机制方面存在复杂的交互作用。一方面，RAS中重要组成部分——Ang II可通过血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin II type 1 receptor, AT1)途径促进20-HETE生成，阻断20-HETE的合成可抑制Ang II依赖性高血压的发展[25];而另一方面，深入研究发现20-HETE又是促进内皮细胞ACE表达的诱导剂和转录激活因子，通过ACE诱导激活RAS[26]。总之，20-HETE除直接作用于血管内皮及平滑肌细胞导致血管功能障碍诱发高血压，还可参与多种诱发因素以及体内活性物质，如雄激素和Ang II依赖性高血压的发生、发展。

如前所述，20-HETE通过激活GPR75机制导致血管内皮细胞NO生物利用度降低，诱发内皮功能紊乱；另一方面，20-HETE-GPR75还可通过激活PKC途径以及抑制BKCa等机制诱导平滑肌细胞内Ca2+水平增高、增加血管紧张度，如上作用是20-HETE参与高血压发生发展的重要机制。Garcia等[6]在CYP4A12转基因小鼠诱导的20-HETE依赖性高血压中研究证实，GPR75激活是20-HETE促高血压反应的必要条件。该研究中发现，敲除GPR75有效降低了多西环素处理的CYP4A12转基因小鼠血压升高效应，同时在敲除GPR75后，血管中20-HETE诱导的ACE表达水平显著降低，改善血管内皮细胞功能紊乱，并减少血管平滑肌对于肾上腺素的收缩反应，阻断了20-HETE诱导的肾脏微血管管壁厚度和直径的增加。总之，在20-HETE依赖性高血压中，20-HETE诱导的平滑肌紧张度增高、血管内皮功能紊乱以及血管重塑等作用，依赖于GPR75的激活，敲除GPR75的表达发挥类似20-HETE抑制剂的同样作用，提示GPR75可能是治疗高血压的可行靶点，这也是首次发现GPR75在高血压的发病中发挥作用。

Figure 2.The signaling pathways of 20-HETE-GPR75 pairing-induced contraction of vascular smooth muscle cells (VSMCs). 20-HETE binds to GPR75 and functionally activates the receptor in VSMCs. This leads to elevate cytosolic Ca2+ level via mechanisms that include activation of Ca2+ channel in the membrane, IP3 receptor-gated Ca2+ channel, and inhibition of the BKCa channels though dissociation of the Gαq/11 subunit and release of c-Src from GIT1, as well as maintain the phosphorylated state of myosin light chain which further sensitizes the VSMCs to Ca2+ by Rho-associated kinase, all of which can stimulate VSMC contraction, leading to the development of hypertension. VGCC: voltage-gated calcium channel; BKCa: large-conductance calcium-activated potassium channel; GIT1: GPCR kinase 2-interacting protein 1; HIC-5: hydrogen peroxide-inducible clone 5 protein; PIP2: phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3: inositol trisphosphate; DAG: diacylglycerol; PKC: protein kinase C; ROCK: Rho-associated kinase; MLCK: myosin light chain kinase.

5 问题与展望

在心血管系统中，20-HETE是一种强效的血管收缩剂，其水平的升高会促进高血压、脑卒中、心肌梗死等心血管疾病的发生及发展[4]。因此，GPR75受体的发现为深入了解20-HETE调控血压、参与心血管疾病机制提供了新思路，但该发现也为深入研究提出了诸多问题与挑战。首要问题是确定GPR75是否在20-HETE发挥作用的所有组织中表达并介导其生物学效应？在人体及动物实验研究中发现，CYP4A在肾脏中的近端小管、髓袢以及肾血管系统中高表达，是合成20-HETE重要部位，通过钠尿排泄调节参与血压的调节[27]。然而，Garcia等[6]的研究表明，GPR75的mRNA和蛋白在肾脏中的表达相对较低。因此，很有必要深入研究确定GPR75是否介导了20-HETE在肾脏的钠尿排泄作用。此外，近年研究发现CYP4A和CYP4F在心脏组织中表达，在心肌缺血再灌注损伤进程中20-HETE含量增高，抑制其合成可改善再灌注后心肌功能恢复和减少梗死面积发生[28-29]。笔者所在实验室研究发现，20-HETE具有显著的促进心肌细胞凋亡和肥大的作用[30-32]，可能是20-HETE参与相关缺血性心脏疾病的重要机制。然而，目前仍尚缺乏GPR75在心脏组织中表达以及相关生物学作用的研究报道。

总之，20-HETE在机体内多种组织器官中生成并发挥相应生物学效应，如在脑组织、肺脏、肝脏、心脏、血管平滑肌、中性粒细胞、血小板等[3-4, 9, 11]，而目前为止，针对GPR75在机体内的表达及其功能的研究非常有限，根据Gene Card等数据库公布，GPR75仅在脑和脊髓中mRNA以高水平表达，视网膜色素上皮细胞以及神经节细胞中可检测mRNA水平表达，在胰岛β细胞中蛋白水平表达[8]。由于GPR75目前仍被列为孤儿受体[7]，其生物学作用一直未被阐明，20-HETE-GPR75配对机制研究的发现，一方面为揭示20-HETE生物学作用的分子机制提供了新思路，另一方面由于GPR75介导20-HETE血管升压效应，为进一步探究GPR75功能的研究开辟了重要领域。