羧肽酶E在胃癌组织中的表达及临床意义

李 晶，张慧敏，李书良

(焦作煤业集团责任有限公司中央医院消化内科，河南 焦作 454000)

胃癌作为消化道常见的恶性肿瘤，具有发病率高、病死率高等特点，由于胃癌早期缺乏典型的临床症状，多数患者确诊时已处于中晚期[1]。有研究指出，胃癌5 a生存率低于25%，我国每年因胃癌死亡人数居世界第1位[2]。目前，胃癌的发生、发展机制尚未完全清楚，因此，探讨胃癌发生机制对其早期诊断及改善预后具有重要意义。羧肽酶E(carboxypeptidase E，CPE)作为具有多种功能的蛋白，在调控内分泌及神经递质合成中发挥重要作用[3]，在神经内分泌瘤的发生、进展中发挥关键性作用[4]。近年来研究发现，CPE在肝癌[5]、胰腺癌[6]、乳腺癌[7]等多种非神经内分泌系统肿瘤组织中呈高表达，且与患者预后有关。本研究对胃癌组织中CPE蛋白及基因表达情况进行分析，探讨其与临床病理特征及患者预后的关系，以期为临床实践提供基础资料。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2010年1月至2011年12月在焦作煤业集团责任有限公司中央医院择期行手术治疗的胃癌患者76例，男51例，女25例；年龄29～76(58.3±11.6)岁；病理学类型：管状腺癌57例，印戒细胞癌11例，黏液腺癌5例，乳头状腺癌3例；分化程度：低分化51例，中高分化25例；TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期18例，Ⅲ期30例，Ⅳ期12例；发生淋巴结转移47例。所有患者术前未进行放射治疗和化学治疗，术后均经病理学检查确诊。所有患者术中留取胃癌组织以及距离肿瘤组织边缘 5 cm 以上的癌旁正常组织，均分成2份保存，1份制备石蜡标本，1份快速保存于-70 ℃冰箱备用。所有患者术后随访5 a，随访时间截至2016年12月30日，生存时间定义为手术时间至随访结束或死亡。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者签订知情同意书。

1.2主要试剂与仪器免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人CPE多克隆抗体购自武汉优尔生商贸有限公司，TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Promega公司，反转录和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司，CPE和内参引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成；显微镜购自北京上光仪器有限公司，石蜡切片机购自上海倍曼生物科技有限公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.3免疫组织化学链霉菌亲和素-过氧化物酶链结(streptavidin-peroxidaseconjugated，SP)法检测胃癌及癌旁正常组织中CPE蛋白表达取胃癌及癌旁正常组织石蜡标本，连续切片，厚度约 2 μm，经脱蜡水化后，用微波进行抗原修复，利用体积分数3%过氧化氢对内源性生物素酶进行阻断，加入一抗鼠抗人CPE多克隆抗体(稀释比例1500)，4 ℃过夜孵育，加入二抗，以磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)代替一抗作为阴性对照组。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。结果判定：以细胞质中出现棕黄色或黄褐色颗粒状或团块状物质为阳性染色。所有切片由2名副主任医师或主任医师单独完成阅片，分别根据染色强度和阳性细胞比例进行评分[8]。染色强度评分：无染色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞比例评分：0～5%为0分；6%～25%为1分；26%～75%为2分；76%～100%为3分。总评分=染色强度评分×阳性细胞比例评分，0分为阴性；1～9分为阳性。

1.4实时荧光定量PCR检测胃癌及癌旁正常组织中CPEmRNA表达取胃癌及癌旁正常组织，研磨后加入细胞裂解液，利用TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA并检测样品纯度，利用反转录试剂盒将总RNA反转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板进行PCR。引物序列：CPE上游引物序列为5′-TGTAGATGGAACCACCAACGG-3′，下游引物序列为5′-ACAAATCCTTTAACTCCTCGG-3′；β-actin上游引物序列为5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物序列为5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR反应条件：94 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，连续进行36个循环。每个样品均设3个平行反应复孔。采用2-△△Ct法对胃癌及癌旁正常组织中CPE mRNA相对表达量进行分析。

2 结果

2.1胃癌及癌旁正常组织中CPE蛋白表达比较结果见图1。胃癌组织中CPE蛋白阳性表达61例，阴性表达15例，阳性表达率为80.3%(61/76)；癌旁正常组织中CPE蛋白阳性表达28例，阴性表达48例，阳性表达率为36.8%(28/76)；胃癌组织中CPE蛋白阳性表达率高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(χ2=37.112，P<0.05)。

A：癌旁正常组织；B：胃癌组织。

图1胃癌组织和癌旁正常组织中CPE蛋白的表达(SP，×400)

Fig.1ExpressionsofCPEproteiningastriccancerandadjacentnormaltissues(SP，×400)

2.2胃癌及癌旁正常组织中CPEmRNA表达比较胃癌组织和癌旁正常组织中CPE mRNA相对表达量分别为2.07±0.18和1.39±0.14，胃癌组织中CPE mRNA相对表达量显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(t=25.981，P<0.05)。

2.3胃癌组织中CPE蛋白和mRNA表达与临床病理特征的关系结果见表1。胃癌组织中CPE蛋白和mRNA相对表达量均与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、病理学类型及分化程度无关(P>0.05)，与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度和血管侵犯有关(P<0.05)。

表1胃癌组织中CPE蛋白和mRNA表达与临床病理特征的关系

Tab.1RelationshipbetweenrelativeexpressionofCPEproteinandmRNAandclinicopathologicalfeaturesingastriccancer

临床特征nCPE蛋白阳性/例(%)阴性/例(%)χ2PCPE mRNA相对表达量t/FP年龄 <60岁3329(87.9)4(12.1)2.03±0.16 ≥60岁4332(74.4)11(25.6)2.1350.1442.09±0.200.7820.218性别 男5142(82.4)9(17.6)2.05±0.14 女2519(76.0)6(24.0)0.4270.5132.10±0.190.9750.166肿瘤位置 近端108(80.0)2(20.0)2.03±0.15 中部2821(75.0)7(25.0)0.8640.6492.08±0.162.2480.113 远端3832(84.2)6(15.8)2.06±0.13肿瘤直径 >5 cm3124(77.4)7(22.6)0.2670.6052.04±0.171.5850.059 ≤5 cm4537(82.2)8(17.8)2.08±0.20病理学类型 管状腺癌5746(80.7)11(19.3)2.05±0.14 印戒细胞癌119(81.8)2(18.2)0.3740.9892.02±0.161.1930.318 黏液腺癌54(80.0)1(20.0)2.08±0.18 乳头状腺癌32(66.7)1(13.3)2.10±0.17分化程度 低分化5140(78.4)11(21.6)2.04±0.15 中高分化2521(84.0)4(16.0)0.3280.5672.09±0.191.0630.146TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期3422(64.7)12(35.3)1.91±0.12 Ⅲ+Ⅳ期4239(92.9)3(7.1)9.4000.0022.18±0.179.0910.000淋巴结转移 是4742(89.4)5(10.6)2.22±0.16 否2919(65.5)10(34.5)6.4370.0111.88±0.1410.8090.000浸润深度 累及浆膜4339(90.7)4(9.3)2.19±0.17 未及浆膜3322(66.7)11(33.3)6.8060.0091.94±0.137.4340.000血管侵犯 是2927(93.1)2(6.9)2.24±0.18 否4734(72.3)13(27.7)4.8810.0271.85±0.138.8830.000

2.4胃癌组织中CPEmRNA表达与患者生存时间的关系以胃癌组织中CPE mRNA相对表达量的P25值为界值，将患者分为低表达组(n=19)和高表达(n=57)，Kaplan-Meier生存分析显示，低表达组患者平均生存时间(48.9±3.6)个月，总生存率为57.9%；高表达组患者平均生存时间(34.7±2.7)个月，总生存率为35.1%；低表达组患者总生存率高于高表达组，差异有统计学意义(χ2=4.171，P<0.05)，见图2。

图2胃癌组织中CPE表达与患者生存时间的关系

Fig.2RelationshipbetweentheexpressionofCPEandthesurvivaltimeofpatientswithgastriccancer

3 讨论

胃癌作为恶性程度较高的恶性肿瘤，侵袭能力较强，易出现早期转移，多数患者预后不良[9]。有研究指出，肿瘤发生转移和侵袭是肿瘤细胞与机体细胞之间相互作用的结果，期间有诸多基因参与了这一过程[10]。CPE基因定位于人染色体4q32.3，在神经内分泌系统中扮演重要角色[11]。谭金凤等[12]指出，CPE是肿瘤增殖和转移的潜在标志物。亦有研究指出，CPE表达异常与肿瘤的发生、转移密切相关[13]。有研究利用小分子干扰RNA技术将特异性抑制CPE基因植入胰腺癌裸鼠模型后可抑制肿瘤细胞生长[14]。本研究结果显示，胃癌组织中CPE蛋白阳性表达率和CPE mRNA相对表达量均显著高于癌旁正常组织，说明CPE在胃癌组织中呈高表达，其可能参与了胃癌的发生过程。

有研究发现，CPE过度表达参与了肿瘤转移、侵袭过程[15]。本研究结果显示，胃癌组织中CPE mRNA相对表达量与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、血管侵犯、远处转移有关，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、发生淋巴结转移、累及浆膜、血管侵犯和远处转移患者胃癌组织中CPE mRNA相对表达量显著增加，说明CPE基因可能参与了胃癌的发生、发展过程，在肿瘤转移、侵袭过程中发挥重要作用，与杜月娟等[16]研究结论一致。有研究指出，CPE与肿瘤患者预后密切相关，是预测患者预后的潜在生物标志物[17]。本研究结果显示，CPE mRNA低表达组患者平均生存时间显著高于高表达组，说明胃癌组织中CPE基因表达与患者预后有关，可作为判定患者预后的潜在指标。

综上所述，CPE在胃癌组织中呈高表达，且与胃癌发生、发展及不良预后有关。因此，CPE可能参与了胃癌的发生、发展过程，对指导临床治疗及判定患者预后具有重要意义，但具体调控机制尚待进一步研究。