一株苯酚降解菌株的筛选鉴定及特性研究

任瑞凡　刘永阳　曲文浩　孔令腾　李潇潇　薛智权　吕建华

摘 要：为了从焦化废水活性污泥中筛选出高效降酚的细菌，以对废水中苯酚进行生物处理。以苯酚为唯一碳源，从太谷县某焦化厂活性污泥中筛选苯酚降解菌，同时通过Plackett-Burman试验设计，结合正交试验分析，确定该菌株降解苯酚的最佳条件，通过酶活性测定推测菌株降解途径。结果从活性污泥中分离得到1株苯酚降解菌株B10，经分析16S rDNA序列和构建系统进化树，初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属细菌。通过利用Plackett-Burman试验设计，结合正交试验分析，确定该菌株降解苯酚的最佳条件为：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培养温度30 ℃，硫酸镁1 g·L-1。当以苯酚为唯一碳源时，菌株B10中仅有邻苯二酚1， 2-双加氧酶活性被检测到，因此推测，该菌株通过邻位途径降解苯酚。结果表明，B10菌具有降解苯酚能力，对于治理含酚废水具有应用潜力。

关键词：苯酚；芽孢杆菌属B10；Plackett-Burman试验设计；邻苯二酚1， 2-双加氧酶活性

中图分类号：X172 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.11.004

Study on Screening， Identification and Characterization of A Phenol-degrading Bacterium Strain

REN Ruifan， LIU Yongyang， QU Wenhao， KONG Lingteng， LI Xiaoxiao， XUE Zhiquan， LYU Jianhua

（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi 030801，China）

Abstract： The purpose of this paper is to screen highly effective phenol-degrading bacteria from the activated sludge of coking wastewater for the treatment of phenol in wastewater. The paper took phenol as the sole carbon source， by utilizing phenol as sole carbon source， screening phenol-degrading bacteria from the active sludge of coking plant in Taigu county of Shanxi province， at the same time， the optimum conditions for degradation of phenol were determined by Plackett-Burman experimental design and orthogonal test analysis， and the degradation pathway of the strain was determined by enzyme activity detection. The results showed that a phenol-degrading bacterium strain B10 was isolated from the active sludge. Based on the analysis of the 16S rDNA sequence and the construction of the phylogenetic tree， the strain was identified as Bacillus. Utilizing the Plackett-Burman design， together with orthogonal test analysis， it was confirmed that the optimum degradation conditions of the strain were yeast extract 10 g·L-1， ethanol 4 g·L-1， inoculation volume 2.5%， temperature 30 ℃， magnesium sulphate 1 g·L-1. When phenol was the only carbon source， only catechol 1， 2-dioxygenase activity in strain B10 was detected. Therefore， it was speculated that the strain might metabolize phenol via ortho-cleavage pathway. The results showed that B10 could degrade phenol and had potential application in the treatment of phenolic wastewater.

Key words： phenol； Bacillus sp. B10； Plackett-Burman； catechol 1， 2-dioxygenase activity

苯酚及其衍生物是各種有机化合物的基本结构单元，作为原料已被广泛应用于石油化工、医药、印染、造纸等行业，其工业废水成为含酚废水的主要来源[1-3]。研究表明，即使是极低浓度的苯酚也会使饮用水产生令人反感的味道。当酚类及其衍生物浓度在5～2 000 mg·L-1时，对所有生命体都具有强烈毒性。因此，酚类物质被确定为优先污染物[4-7]。去除工业废水中的苯酚对环境保护具有重要的现实意义。

采用微生物降解苯酚已经进行了至少20年的尝试。有研究表明，许多细菌和酵母菌能够耐受和降解低浓度的苯酚，并且将酚类化合物分解代谢成无害的最终产物，因此，微生物降解是非常有效的处理含酚废水的方法[8]。目前，国内外分离和鉴定到的降解苯酚的微生物包括细菌和真菌两大类。其中，细菌159 种，分属于42个属；真菌53 种，分属于15个属。细菌以假单胞菌属的菌株最多，其次是芽孢杆菌属、产碱菌属、红球菌属和不动杆属；真菌以酵母属最多，其次是假丝酵母属[9]。

采用微生物降解工业废水中的苯酚时，其降解效果会受到许多因素的影响。因此，需要从这些因素中筛选影响显著的因素。采用单因素不能确定主要因素和次要因素，而Plackett-Burman试验能够从诸多因素中快速有效地筛选出最重要的因素[10-11]。

通过对山西农业大学所在地太谷县某焦化厂废水池中的活性污泥进行采集，采用初筛、复筛的方法筛选出高效降酚的细菌，并通过Plackett - Burman试验筛选影响菌降解苯酚的重要因素，利用正交设计对重要因素进一步优化，以筛选出影响菌株苯酚降解率的最佳相关因素，同时对苯酚降解酶活性进行测定，旨在为含酚废水的治理提供重要的理论和实际应用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源 研究所用样品采自于山西省晋中市太谷县某焦化厂废水处理池中的活性污泥，污泥装入灭菌后的三角瓶中封好，放4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培养基 （1）富集培养基。 牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，调pH值为7.0，加水定容，高压蒸汽灭菌，121 ℃，灭菌20 min，冷却后加入两性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚1 g·L-1。（2）无机盐筛选培养基。 K2HPO4 0.4 g·L-1，KH2PO4 0.2 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，MgSO4 0.1 g·L-1，MnSO4·H2O 0.01 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，酵母提取物2.5 g·L-1，琼脂粉15～20 g·L-1，加水定容，高压蒸汽灭菌，121 ℃，灭菌20 min，冷却后加入两性霉素0.002 5 g·L-1，苯酚根据需要量加入。

1.1.3 试剂 试验所用化学试剂均为分析纯，酵母提取物购自OXOID公司，细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR试剂购自北京康为世纪有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苯酚含量的测定 采用4-氨基安替比林法[12]测定苯酚含量，略有改进。将培养液于12 000 r·min-1离心1 min后，取上清30 μL加入到10 mL试管中，加蒸馏水到4 mL，加入40 μL pH值为10的氨水缓冲溶液，加80 μL 2%的4-氨基安替比林，混匀，再加入80 μL 8%的铁氰化钾溶液，混匀，15 min后，在510 nm处测吸光度。

1.2.2 降酚菌株的分离与纯化 配制100 mL的富集培养基，高压灭菌后加入终浓度0.002 5 g·L-1的两性霉素溶液和终浓度1 g·L-1苯酚溶液混匀，挑取采集的污泥样品接种到培养基中，置于28 ℃，180 r·min-1的摇床上振荡培养2 d。将富集培养液梯度稀释101，102，103，104，105倍，然后分别取104和105倍稀释液100 μL 接种到苯酚浓度（m/V）为1.5，2.0，2.5 ，3.0 g·L-1无机盐固体培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d。挑取无机盐固体培养基上生长的不同形态的单菌落，接种于富集培养基中，于28 ℃，180 r·min-1的摇床上振荡培养16 h后，按照5%的接种量接种于苯酚浓度为1 g·L-1的无机盐液体培养基中，并且按照同样的方法，用水代替菌液作陰性对照，置于28 ℃，180 r·min-1的摇床上培养。然后在24 h时使用4-氨基安替比林分光光度法测定苯酚浓度，计算苯酚降解率，筛选出苯酚降解率高的菌株用于后续试验。

苯酚降解率=（未接菌前培养液苯酚量-培养结束培养液残余苯酚量）/未接菌前培养液苯酚量×100%

1.2.3 降酚菌株的分子和形态特征鉴定 取1 mL菌株培养液，10 000 r·min-1，离心1 min，尽量吸掉上清液，根据细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书提取菌株基因组DNA。16S rDNA采用细菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3）及1492R （5-GGTTACCTT GTTACGACTT-3）进行扩增，PCR体系（25 μL）：2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTP mix（2.5 mmol·L-1），0.5 μL 27F（10 μmol·L-1），0.5 μL 1492R（10 μmol·L-1），3 μL 细菌基因组DNA，水16 μL，0.5 μL Taq DNA聚合酶。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物由北京华大基因有限公司进行纯化测序。然后，通过BLAST与NCBI数据库序列进行比对，并通过MEGA 5.0软件采用邻接法构建系统进化树。

菌体形态特征鉴定通过采用结晶紫和碘液先后染色，乙醇脱色，番红复染的方法对菌株进行革兰氏染色，采用Olympus DP71高倍显微镜观察菌体结构特征。

1.2.4 降酚菌株降解特性的优化 试验以苯酚降解率为响应目标，采用Plackett-Burman试验设计，选取温度、pH值、摇床转数、初始接菌量、苯酚初始浓度、葡萄糖、甲醇、乙醇、酵母膏、硫酸铵、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化铁、氯化钠、硫酸镁16个模拟工业废水中对菌株降解苯酚具有影响的相关因素进行设计，通过回归分析，比较各个因素两水平的差异与整体的差异来确定因素的显著性，从而得到对菌株降解苯酚有显著影响的因素，再用正交试验进一步优化菌株最佳降解条件，并进行验证。用Minitab 15软件设计试验并进行数据处理。

1.2.5 不同浓度苯酚对降酚菌株生长的影响 将纯化的菌株再次接种到以苯酚为唯一碳源，浓度分别为1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，

2.5 g·L-1的无机盐固体培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养7 d，以确定菌株耐受的最高苯酚浓度。

1.2.6 粗酶液的提取 将筛选出的菌株接种到富集培养基中，培养24 h后接种到以1 g·L-1苯酚为唯一碳源的液体无机盐培养基中，30 ℃，180 r·min-1振荡培养，取对数生长期后期菌液10 mL，4 ℃，12 000 r·min-1高速离心5 min，收集菌体，上清液留取待用，菌体用pH值为6.8磷酸盐缓冲液清洗2次，然后用磷酸盐缓冲液重悬细胞，加入终浓度为10 mg·mL-1的蛋白酶K，用SCIENTZ98-III杯式超声破碎仪破碎细胞， 超声破碎30 s，间隔25 s，连续超声45 min，4 ℃，12 000 r·min-1离心20 min，收集上清液即为粗酶液[13]。

1.2.7 酶活的测定 （1）苯酚羟化酶活力测定。苯酚羟化酶活力严格依赖于NADPH的存在，NADPH在340 nm处有吸收，通过在波长340 nm处测定NADPH的减少速度来表示。一个单位（U）的苯酚羟化酶活性被定义为每毫克蛋白每分钟氧化1 μmol NADPH所需的酶量。酶活测定参照文献[14]进行检测。（2）邻苯二酚-1， 2-加氧酶（C12O）活力测定。以单位时间内反应产物（粘糠酸）在260 nm处吸光度变化表示。（3）邻苯二酚-2， 3 加氧酶活力测定。以单位时间内反应产物（2-羟基粘糠酸半醛）在375 nm处吸光度变化表示。一个单位（U）的邻苯二酚1，2（或2，3）双加氧酶活性被定义为每毫克蛋白每分钟产生1 μmol黏糠酸（或2-羟基黏糠酸半醛）所需的酶量[15]。双加氧酶活性测定参照文献[16]进行检测，以磷酸盐缓冲液为参比。总蛋白含量用Bradford 法测定[17]。酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算。

酶的比活力=（ （ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]） 式中，ΔAs表示样品吸光度的变化值；ΔAb表示空白对照吸光度的变化值；V表示反应体系总体积；ε表示摩尔吸光系数；ΔT表示反应时间。ε340 = 6 220 L·（mol-1·cm-1），ε260 = 16 800 L·（mol-1·cm-1），ε375 = 44 700 L·（mol-1·cm-1）。

2 结果与分析

2.1 降解苯酚细菌的筛选和鉴定

经过初筛和复筛，获得13种苯酚降解细菌，分别编号B1～B13。将13株菌进行苯酚降解率测定，得到1株降解率最高的菌株，菌株在苯酚浓度为1 g·L-1时的无机盐液体培养基中，经28 ℃，180 r·min-1培养24 h，可使苯酚降解率达到47.9%。提取菌株基因组DNA后，通过细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增并测序，得到长度为1 447 bp的扩增产物，序列（GenBank登录号：MG738215.1）经BLAST与NCBI 数据库中登录的序列比对分析，结果表明，它与Bacillus sp. KT981880.1序列有99%相似性，初步鉴定该菌株为Bacillus属细菌，命名为Bacillus sp. B10。菌株的系统进化树如图1所示。经革兰氏染色确定该菌株为革兰氏阳性菌，菌落形态呈杆状，并且有芽孢生成，结果如图2所示。

2.2 Plackett-Burman设计筛选降解苯酚重要因素

采用试验次数N=16的Plackett-Burman试验设计对模拟工业废水中影响菌株Bacillus sp. B10苯酚降解率的16个因素进行研究，每组重复3次。试验设计及结果如表1所示，各因素主效应分析如表2所示，应用Minitab软件分析模型的P=0.046，说明试验结果可信。苯酚降解率回归分析复相关系数为0.980 2，调整后为0.874 6，说明数据对模型的拟合度较好。根据主效应分析結果，将置信度高于90%的因素作为进一步优化的因素，可知影响B10菌降解苯酚的显著性因素依次为酵母膏、初始接菌量、硫酸镁、培养温度和乙醇，而其他因素对菌B10的苯酚降解率没有显著影响。

2.3 正交优化试验设计

根据Plackett-Burman试验设计结果，本试验选择可信度大于90%以上的因素作为重要因素，因此选择酵母膏（L）、初始接菌量（D）、硫酸镁（T）、温度（A）和乙（J）5个因素，进行5因素4水平正交设计，选用L16（45 ）正交试验表进行。正交试验设计因素水平表及结果如表3所示。方差分析如表4所示。

由极差分析结果可知，对B10菌苯酚降解率影响的因素次序为乙醇>酵母膏>初始接菌量>温度>硫酸镁；方差分析结果表明，酵母膏、乙醇和初始接菌量为显著影响因素，温度和硫酸镁影响不显著。因此，可确定影响B10菌苯酚降解率的最佳条件为：酵母膏10 g·L-1，乙醇4 g·L-1，初始接菌量2.5%，培养温度30 ℃，硫酸镁1 g·L-1。

2.4 不同浓度苯酚对降酚菌株生长的影响

将菌株分别接种于以1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，

2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5 g·L-1苯酚为唯一碳源的无机盐固体培养基上，28 ℃恒温培养箱培养7 d后观察发现，该菌株在苯酚浓度为2.3 g·L-1及其以下浓度的无机盐固体培养基上均有菌落生长，而在苯酚浓度为2.4～2.5 g·L-1上均无菌落生长。说明该菌株最大苯酚耐受浓度为2.3 g·L-1。

2.5 菌株苯酚代谢途径分析

通过测定B10菌株粗酶液中苯酚羟化酶、邻苯二酚1，2-加氧酶和邻苯二酚2，3-加氧酶的活性，初步判断该菌株降解苯酚途径。在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养液中，菌体粗酶液中苯酚羟化酶的比活力为（0.030 9±0.017 5）U·mg-1蛋白质，未破碎细胞上清液中苯酚羟化酶比活力为（0.093 8±0.002 1）U·mg-1，表明该酶可能为胞外酶，但尚有待进一步验证。邻苯二酚1， 2-加氧酶的比活力为（0.062 6±0.011 7）U·mg-1蛋白质，而邻苯二酚2， 3-加氧酶的活性未检测到，因此，推断该菌株降解苯酚以邻位开环降解为主。菌体破碎后上清液中邻苯二酚1， 2-双加氧酶的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，表明该酶为胞内酶。