挂膜方式对流化床生物滤器启动及细菌群落结构的影响

张海耿， 单建军， 顾川川， 管崇武， 张宇雷， 倪 琦

(农业部渔业装备与工程技术重点实验室，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所，上海 200092)

循环水养殖系统(RAS)模式逐渐在世界各国水产养殖领域得到重视和应用，是未来水产养殖业的主要发展方向之一。生物滤器的生物过滤环节是循环水养殖系统水处理的核心部分，生物滤器在正常运转前需对滤器中的微生物进行挂膜培养，生物滤器常见的启动方式主要有自然挂膜法、微生物接种挂膜法和活性污泥挂膜法[1-3]。流化床生物滤器是一种极具开发潜力和竞争力的生物过滤器，具有高效、可控、占地面积小等优点，逐渐在循环水养殖领域推广应用[4]。目前，国内外学者对流化床生物滤器的研究主要集中于装置的结构[5]、水力特性[6]、硝化性能[7]等方面，对于该滤器挂膜方式的研究还鲜有报道。不同的挂膜方式可能会影响生物滤器中微生物的生长与繁殖，而生物滤器中载体表面微生物群落的变化和代谢情况又与滤器的水处理性能密切相关[8]。因此，开展流化床生物滤器挂膜方式研究有助于更深入地了解流化床生物滤器的运行特征及净水机制。

高通量测序技术作为新一代测试技术，可全面精准地分析不同领域中的微生物的丰度和群落特征。目前，该技术已在环境工程[9-10]、农学[11-12]、生命科学[13-14]、海洋科学[15-16]等领域逐渐得到应用，同样，该技术也为揭示流化床生物滤器的挂膜过程及净水机制提供了可能。

本研究构建了2套中华鲟循环水养殖系统，生物过滤环节采用流化床生物滤器，并选用玻璃微珠为滤器的填料；分析在自然挂膜法和微生物接种挂膜法两种启动方式下流化床生物滤器的挂膜过程，并采用高通量测序方法，研究不同时期流化床生物滤器中微生物群落的变化，旨在研究不同启动方式对流化床生物滤器中微生物群落的结构变化和种类的影响，以期了解流化床生物滤器的净水机制，并通过优化滤器启动时的运行参数，为其在循环水养殖系统中的高效运行提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 中华鲟循环水养殖系统

试验在中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所如东中试基地的2套RASs中进行。该系统主要由养殖池、竖流沉淀池、微滤机、调节池、流化床生物滤器、低压纯氧混合装置(LHO)和紫外杀菌装置组成(图1)，总水体约80 m3。其中，养殖池为方形圆角池，池深1.6 m，有效水体70 m3；流化床生物滤器筒体直径1.2 m，高3 m，滤料放置高度1.2 m，滤器布水方式采用底部双切向进水，通过漩涡流推动滤料均匀向上膨胀；离心泵流量50 m3/h，养殖水体循环量1.6 h/次。每天对养殖池及竖流沉淀池定时排污，RAS每天的补水量约为总水体的3%。

试验养殖对象中华鲟，初始平均质量(40.22±1.05) kg，每个池子放12尾，初始投放密度6.8 kg/m2，日投饲率为体质量的0.3%。试验期间，养殖水温控制于(18±1)℃，溶氧(DO)>7 mg/L。

1.2 试验设计

在流化床生物滤器运行5 d、25 d、60 d，分3次采集生物膜样品，每次采集3个样品。其中，试验组样品记为A、B、C，对照组样品记为D、E、F。采样点为流化床生物滤器的中部区域，样品采集后迅速放置-20 ℃保存，等样品全部采齐后，一起送美吉生物有限公司进行分析。

1.3 样品测序

对样品进行总DNA提取，而后采用细菌通用引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTACAG-3)和533R(5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3)对样品进行聚合酶链式扩增(PCR)。PCR反应过程为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环，72 ℃延伸5 min。而后，将扩增产物使用2%琼脂糖进行凝胶电泳分析，在Roche 454 GS FLX+ Titanium平台上进行高通量测序。

1.4 生物信息学分析

利用Uparse (version 7.1) 对样品的有效序列进行聚类，默认将97%相似水平的序列类聚成操作分类单元(OTU)。采用RDP classifier 贝叶斯算法对TU进行分类学分析，并将OTU选取的代表性序列与silva(SSU123)库进行对比[17]，利用Mothur 软件构建稀释性曲线(rarefaction curve)[18]，并计算Shannon 指数[19]。

1.5 水质测定方法及数据处理

2 结果与讨论

2.1 两种挂膜方式下流化床生物滤器的启动过程

图2显示了不同挂膜方式流化床生物滤器进出水TAN变化情况。由图2可知，挂膜初期，由于生物膜尚未成熟，滤器对TAN的去除能力较弱，系统中TAN质量浓度逐渐升高。随着挂膜时间的延长，TAN开始下降，对照组对TAN的去除速度快于试验组，经过约1个月的挂膜，生物滤器可将系统中的TAN质量浓度维持在0.2 mg/L，说明在该工况下流化床生物滤器可成功启动。

图2 不同挂膜方式下流化床生物滤器进出水TAN变化情况

图3 不同挂膜方式下流化床生物滤器进出水变化情况

2.2 不同工况下流化床生物滤器微生物群落结构变化

2.2.1 不同样品碱基序列分布及生物多样性

测序结束后将测序接头及引物序列去除，并对处理后的有效序列进行数据及长度分布统计。为提高后续生物信息分析的准确性，对有效序列进行优化，包括：1)利用特异性引物信息将非特异性扩增片段序列去除；2)丢弃长度短于150 bp、含有模糊碱基(Ns)、引物碱基含2个以上错配、单碱基重复超过6个的序列，采用焦磷酸测试方式对该样品进行了系统分析。6个样品共测得碱基序列34 130条，平均碱基长度为437 bp。

将优化序列截齐后，与SILVA106库比对进行聚类，利用焦磷酸测序法可以获得更丰富的生物信息，而且即使测序序列数量超过6 000，仍有新的OTU可以测出。本研究中6个样本的测序深度指数均高于0.9(P<0.1)，即样本OTU可以有效表征样本中微生物种群。从多样性指标分析，随着挂膜天数的增加，两种挂膜方式下微生物的种类在逐渐增加，挂膜60 d后，两种工况下样品的多样性指数分别为3.42和3.21，说明采用自然挂膜的方式，生物膜成熟后细菌的群落多样性更高。

2.2.2 不同工况下样品的物种差异

Venn图更能直观地反映载体表面不同阶段微生物种类的差别(图4)。两种挂膜方式下，随着挂膜时间的增加，载体上的微生物种类有一定的变化，不同时期存在一些各自特有的种属和共有的种属。采用自然挂膜方式时，有13个OTU一直存在于挂膜的各个时期，A期和B期、B期和C期、A期和C期的相似性指数分别为32.8、39.3和19.1，相邻时期的相似性指数较大，表明不同时期生物载体上微生物的群落结构是在变化的，但是演替的过程是缓慢而有规律的，这样驯化成功的生物膜不容易脱落，比较稳定。而采用添加微生态制剂挂膜时，有12个OTU一直存在于挂膜的各个时期，D期和E期、E期和F期、D期和F期的相似性指数分别为15.8、67.5和15.7，其中，D期和E期、D期和F期的相似性指数相对偏低，D期检测的OUT也相对偏少，说明微生态制剂里本身的菌种在载体挂膜时丰度不高，并且随着时间的推移，逐渐被其他优势菌所取代，微生态制剂中菌种本身的功能并未发挥应有的作用。

图4 不同样品Venn图

2.2.3 不同工况下样品的群落结构分布

自然挂膜5 d时，载体表面微生物种类较少，优势细菌是厚壁菌门(Firmicutes，99.75%)。Lan等[21]认为厚壁菌与脱氮相关，在有氧或缺氧的环境中能够进行硝化、反硝化过程。当载体挂膜25 d时，微生物的种类逐渐增多，但优势种类仍是厚壁菌门(Firmicutes，84.57%)，其次为放线菌门(Actinobacteria，10.82%)和变形菌门(Proteobacteria，3.68%)。随着挂膜天数的增加，载体表面门水平的微生物种类更加丰富，共筛选出15个门，包括厚壁菌门(Firmicutes，45.18%)、变形菌门(Proteobacteria，22.57%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，7.74%)、放线菌门(Actinobacteria，7.68%)、Candidate_division_TM7(6.73%)、浮霉菌门(Planctomycetes，3.7%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，1.86%)、绿弯菌门(Chlorobi，2.19%)、酸杆菌门(Acidobacteria，0.86%)、Candidate_division_OD1(0.64%)、绿菌门(Chlorobi，0.38%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae，0.35%)、纤维杆菌门(Fibrobacteres，0.05%)、蓝藻门(Cyanobacteria，0.04%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，0.02%)。

挂膜初期，微生态制剂中细菌的种类并不多，其优势菌种为厚壁菌门(Firmicutes，99.06%)，另筛选出Candidate_division_TM7(0.04%)和Candidate_division_OD1(0.02%)两类门，该菌群在前者工况下中后期才稳定成熟，说明微生态制剂的添加在一定程度上丰富了生物滤器中细菌的种类。与采用自然挂膜方式相似，随着挂膜天数的增加，其载体表面门的种类逐渐增多。当挂膜60 d时，共筛选出18个门，其优势菌群为拟杆菌门(Bacteroidetes，48.75%)、变形菌门(Proteobacteria，41.09%)和厚壁菌门(Firmicutes，4.93%)，并筛选出螺旋菌门(Spirochaetae，0.08%)、软壁菌门(Tenericutes，0.04%)和Candidate_division_SR1(0.02%)等在自然工况没有出现的新型菌门。

将样品中的微生物继续细分至细菌属可以更好地了解微生物在流化床中的功能，通过与SILVA106数据库进行比对，共鉴定出156个微生物属，与之前研究相比(10～40 种微生物)[22-24]，利用高通量测序可以更全面地了解生物过滤中微生物的组成，更好地了解污染物的去除机理。2种挂膜方式下，挂膜初期微生物种类较少，主要以厚壁菌门中的芽胞杆菌(Bacillus)为主。随着挂膜天数的逐渐增加，其微生物种类在不断丰富。屈挠杆菌属(Flexibacter)是拟杆菌门(Bactervidetes)中的一类细菌，革兰氏阴性菌在一些自然及人工的污水处理系统均有被检测到[25]。另外，自然挂膜方式下，筛选出的功能性细菌，其比例高于采用接种挂膜方式。黄杆菌属(Flavobacterium)是一类兼性厌氧细菌 ，能在低氧情况下硝酸盐被转化成各种还原性产物[26-27]，说明滤器中存在一定的反硝化过程。占α-Proteobacteria纲一定比例的Rhodobacter菌属是一种紫色非硫细菌( purple nonsulfur bacteria) ，这种细菌的最大特点是能够利用多种有机物作为碳源进行异养的光合代谢反应，基质利用的多样性使得它们在滤器中具有一定的优势[28-29]，从而成为优势菌属出现在生物膜的中后期。

3 结论

流化床生物滤器采用自然挂膜或添加微生物制剂都可成功启动，但通过添加微生态制剂可缩短滤器的挂膜时间。两种挂膜方式下，相邻时期微生物的相似性指数较大，表明不同时期生物载体上微生物的群落结构是在变化的，但是演替的过程是缓慢而有规律的。采用自然挂膜的方式，生物膜成熟后细菌的群落多样性高于接种微生态制剂，说明自然挂膜方式微生物群落结构更稳定。挂膜初期，两类工况下载体表面微生物种类较少，其优势细菌都是厚壁菌门，随着挂膜天数的增加，其载体表面微生物种类逐渐增多，通过与SILVA106数据库进行比对，共鉴定出156个微生物属。另外，自然挂膜方式下，筛选出的功能性细菌的比例高于采用接种挂膜方式，如黄杆菌属(Flavobacterium)和紫色非硫细菌(purple nonsulfur bacteria)等，在养殖水体中污染物的转化及去除方面起着重要的作用,说明采用自然挂膜法更利于流化床生物滤器的稳定运行。

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