KDM5B基因在乳腺癌中的表达及其临床意义*

熊志勇， 吴珏堃， 林良奕

(1中山大学附属第三医院甲状腺乳腺外科， 广东 广州 510630; 2中山大学附属第三医院岭南医院普外科， 广东 广州 510530)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高[1]。乳腺癌的发生与遗传、激素影响、生活方式等因素相关，但其具体发病机制尚未明确。组蛋白修饰在生物体生长发育过程中发挥着重要作用，其与基因沉默、基因激活、肿瘤生成、染色体形态建成以及遗传物质修复等生物学问题密切相关[2]；在乳腺癌的发生发展中组蛋白修饰也发挥了重要的作用，组蛋白修饰染色质，使之形成更紧凑的形式，从而抑制基因转录。雌激素受体(estrogen receptor,ER)与组蛋白调控的通路可以各级串扰，如 ERa 的表达和活性。在一些乳腺癌中，可通过组蛋白脱乙酰抑制或减少雌激素受体的表达，这可能是内分泌抵抗的一种机制[3]。赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶5(lysine-specific demethylase 5, KDM5)家族蛋白均含有JMJC结构域，能够去除组蛋白H3上第4位赖氨酸的三和二甲基标记。KDM5家族包括KDM5A、KDM5B、KDM5C和KDM5D等，其均与肿瘤密切相关[4]。

研究表明，KDM5B及其负调控因子微小RNA-448(microRNA-448, miR-448)通过肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1) 的过表达在三阴性乳腺癌的转移和进展中起关键作用[5]。但目前KDM5B基因在乳腺癌中表达的临床意义尚需进一步研究。本研究通过肿瘤基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库及临床乳腺癌样本，分析KDM5B在乳腺癌中的表达差异的临床意义及对预后生存的影响，为进一步阐明KDM5B在肿瘤发生发展中的作用机制提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 数据资料收集

从TCGA数据库收集113例正常乳腺组织和1 090例乳腺癌数据集，下载KDM5B基因表达谱资料。TCGA中样本数据来源的肿瘤病人自愿捐赠肿瘤组织及正常组织样本，由人类的肿瘤生物标本核心资源库承担的肿瘤组织标本和正常组织标本的采集、处理和分配工作，组织样本经过严格标准处理确保质量,可以用于进一步分析及测序，并由相关中心采用高通量测序技术进行基因和基因组排序。利用Bioconductor/TCGAbiolinks函数包从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga)下载并预处理乳腺癌数据集的mRNA表达数据，利用Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast)在线分析KDM5B基因的表达与乳腺癌及三阴性乳腺癌患者预后的相关性。

2 一般资料

收集中山大学附属第三医院甲乳外科2015～2016年乳腺癌切除标本共90例，每例标本包括肿瘤组织及癌旁乳腺组织(距离肿瘤组织边缘2 cm以上)。所有病例术前均未接受放疗、化疗等治疗。新鲜组织标本离体后半小时内放入液氮速冻，后转入-80 ℃冰箱保存。所有乳腺癌病例均有病理学诊断证实，全部病例均为女性，平均年龄(43.8±11.2)岁。患者已签署由医院伦理委员会批准的患者知情同意书，符合医学伦理学规定。

3 Real-time PCR检测乳腺癌组织及癌旁乳腺组织中KDM5B的mRNA表达

按RNA提取试剂盒的步骤提取RNA，用分光光度计进行RNA浓度和纯度分析。将提取的总RNA逆转录为cDNA。使用Primer 5.0软件设计KDM5B及内参照β-actin的引物序列，见表1。将1 μL cDNA、0.5 μL目的基因上游引物、0.5 μL目的基因下游引物、8 μL SYBR和8 μL双蒸水建立20 μL的反应体系，按“98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，42次循环；72 ℃ 10 min”的反应条件进行扩增。用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 Real-time PCR实验引物设计序列

4 数据集的筛选和临床资料参数相关性研究

提取TCGA数据集中乳腺癌病例中的临床参数和生存资料数据。根据KDM5B表达量的资料，将数据按照中位数二等分，分别设为高表达组和低表达组。为分析KDM5B的表达与乳腺癌预后的相关性，我们从TCGA数据库中下载了乳腺癌KDM5B mRNA表达数据和相应肿瘤患者生存时间数据，利用Kaplan-Meier plotter对这些肿瘤的数据集进行在线生存分析。

5 统计学方法

计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 17.0统计软件分析。均数比较采用t检验和方差分析，基因表达与患者临床病理参数之间的关系采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 KDM5B基因在乳腺癌中的表达

利用TCGA的数据我们分析了113例正常乳腺组织和1 090例乳腺癌中KDM5B mRNA的表达情况，KDM5B在乳腺癌中的相对表达水平显著高于正常乳腺组织(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The mRNA expression level of KDM5B in breast can-cer tissues in TCGA database. Mean±SD. **P<0.01 vs tumor group.

通过使用real-time PCR技术,我们在90例乳腺癌患者的组织中均检测到KDM5B的表达，KDM5B在乳腺癌中的相对表达水平显著高于癌旁乳腺组织(P<0.01)，见图2。

Figure 2.The mRNA expression level of KDM5B in breast cancer tissues and adjacent tissues from 90 breast cancer patients. Mean±SD.n=90.**P<0.01 vs tumor group.

2 KDM5B表达与临床病理资料的相关性

在TCGA的乳腺癌数据中，KDM5B的表达与人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)、患者年龄、雌激素受体(estrogen receptor, ER)、病理组织类型和淋巴结转移显著相关，与孕激素受体(progesterone receptor, PR)、绝经和远处转移无显著相关。在所收集的乳腺癌样本中，KDM5B的表达与HER2、年龄和淋巴结转移显著相关，与ER、PR、绝经、病理组织类型和远处转移无显著相关，见表2。

表2 KDM5B表达与乳腺癌临床病理特征的相关性

3 KDM5B表达与乳腺癌及三阴性乳腺癌预后的相关性

KDM5B的表达与乳腺癌预后的相关性分析表明，KDM5B的表达与乳腺癌患者的总生存期(HR=1.39,P=0.005)和无病生存期(HR=1.32,P<0.001)均有相关性，乳腺癌患者标本中KDM5B表达越高，其总生存时间和无病生存时间越短，见图3、4。

Figure 3.Effect of KDM5B expression on overall survival of breast cancer patients.

Figure 4.Effect of KDM5B expression on disease-free survival of breast cancer patients.

讨 论

表观遗传是指基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化，表观遗传改变通过对基因表达进行重新编程从而有助于肿瘤发生[6]，表观遗传标记的变化是可逆的这一特性，使表观遗传调节剂成为非常有吸引力的药物靶标[7]，因此，从表观遗传改变切入肿瘤的研究有望研发新的抗肿瘤药物。研究显示KDM5B表达与STING在多种肿瘤类型中的表达成反比，与肿瘤内CD8+T细胞的水平成反比，这些结果证实了免疫应答的一种新的表观遗传调控途径，提示KDM5是抗病原体治疗和抗癌免疫治疗的潜在靶点[8]。KDM5B与多种肿瘤的发生发展密切相关，包括有头颈部鳞癌[9]、肺癌[10]和乳腺癌[8]等。因此，对KDM5B在乳腺癌中相关机制及临床意义的深入研究，有助于提高乳腺癌的诊治及预测水平。

本研究利用TCGA的数据及临床乳腺癌样本分析了乳腺癌中KDM5B mRNA的表达，显示KDM5B在乳腺癌显著高于正常乳腺组织；进一步结合临床病理资料分析，在TCGA的乳腺癌数据中，KDM5B的表达与HER2、年龄、ER、病理组织类型和淋巴结转移显著相关，而与PR、绝经和远处转移无显著相关。在我们收集的乳腺癌样本中，KDM5B的表达与HER2、年龄和淋巴结转移显著相关，与ER、PR、绝经、病理组织类型和远处转移无明显相关。HER2表达阳性的乳腺癌复发转移风险更大，我们的结果与前期研究报道[5]的KDM5B与MALAT1具有相关性这一结果相一致。生存分析显示KDM5B表达越高，乳腺癌患者总生存时间和无病生存时间越短。