UV法或HPLC法结合金属离子沉淀法测定米索硝唑pH敏感脂质体中主成分含量的比较Δ

魏巍，何美，王琛，李睿，李必波#，罗治彬，2（.重庆市人民医院肿瘤血液科，重庆 000；2.西南医科大学附属医院肿瘤科，四川 泸州 66000；.重庆市肿瘤研究所肿瘤防治办公室，重庆 0000；.重庆药友制药有限责任公司，重庆 02）

米索硝唑是一种具有较高放射增敏比的乏氧细胞放射增敏剂，其放射增敏比为1.5[1]，最高可增至1.8～2.0[2]，常用于头颈部鳞状细胞癌的放疗增敏。但因其水溶性低、油水分配系数高导致其不良反应发生率高，主要为外周神经系统毒性（发生率为15%～28%），故而限制了其临床应用[3-4]。为此，本课题组将米索硝唑包裹于pH敏感脂质体中制成米索硝唑pH敏感脂质体，以此来克服药物的外周神经毒性，并使其具有肿瘤靶向性[5-8]。

药物含量测定是制剂质量控制中非常重要的项目。既往米索硝唑相关检测均采用高效液相色谱法（HPLC）测定原药或其代谢产物[9-10]，该法准确、可靠，但对仪器的要求较高，且测定过程烦琐、耗时、耗材。相比之下，紫外分光光度法（UV）操作简单、费用更低，且在一定质量浓度范围内检测较为准确。然而，本课题组前期研究发现，米索硝唑pH敏感脂质体中的辅料磷脂酰乙醇胺对UV法测定药物含量的干扰大。如能通过简单的物理或化学预处理法，将脂质体中的磷脂酰乙醇胺除去，则可为UV法的应用奠定基础。为此，本研究拟采用金属离子沉淀法（以ZnCl2为金属离子沉淀剂）预处理除去米索硝唑pH敏感脂质体中的磷脂酰乙醇胺，进而采用UV法测定其中主成分的含量，并将结果与HPLC法比较，为实现快速、简便、准确、低廉地测定该制剂中主成分的含量提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括VWD紫外检测器等（美国Agilent公司）；ML204型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；UV-2400PCS型紫外-可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PHS-3C型pH计（上海三信仪表厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海振捷实验设备有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵（河南予华仪器制造有限公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；SK1200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；TGL-16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ZRS-8G型智能溶出仪（天津大学无线电厂）。

1.2 药品与试剂

米索硝唑原料药（青岛捷世康生物科技有限公司，批号：20170219，纯度：≥98.5%）；米索硝唑对照品（美国Cayman公司，批号：15606-201610，纯度：99.5%）；磷脂酰乙醇胺、胆固醇、亚油酸、维生素E、羧甲基壳聚糖（羧化度：80%）、ZnCl2均为药用级；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 米索硝唑pH敏感脂质体的制备

采用薄膜分散法制备米索硝唑pH敏感脂质体。按处方辅料配比分别精密称取磷脂酰乙醇胺、胆固醇、亚油酸、维生素E（比例为3∶1∶1∶0.1，m/m/m/m）各适量，置于同一100 mL圆底烧瓶中，加入10 mL氯仿使溶解，将烧瓶连接旋转蒸发器，在37℃、100 r/min、减压条件下挥干氯仿，得贴于烧瓶内壁一层均匀的薄膜；加入含米索硝唑的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）（药液比为1∶9，m/m）使溶解，在50℃、100 r/min、避光条件下水化60 min，得微黄色脂质体溶液；将上述脂质体溶液超声（功率：180 W，频率：40 kHz）处理10 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，加入0.5 mL 0.3%羧甲基壳聚糖溶液，在50℃、100 r/min、避光条件下继续水合0.5 h，即得米索硝唑pH敏感脂质体。另不加入米索硝唑，同法制备空白脂质体。取上述空白脂质体5 mL，按处方比例加入适量米索硝唑溶液，物理混匀，即得空白脂质体+米索硝唑溶液。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取在五氧化二磷中干燥12 h后的米索硝唑对照品12.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，制成米索硝唑质量浓度为0.48 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 辅料溶液 按处方辅料配比分别精密称取磷脂酰乙醇胺、胆固醇、亚油酸、维生素E各适量，先以氯仿溶解，随后加入甲醇稀释，制成磷脂酰乙醇胺、胆固醇、亚油酸、维生素E质量浓度分别为2.33、0.82、0.84、0.08 mg/mL的混合溶液；羧甲基壳聚糖以水溶解制成质量浓度为0.02 mg/mL的溶液。将上述2种溶液等体积混合，即得。

2.2.3 未经预处理的空白脂质体溶液 精密量取“2.1”项下空白脂质体100 μL，加入900 μL甲醇破乳，涡旋5 min混匀，室温静置15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.2.4 经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液 精密量取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体100 μL，加入800 μL甲醇破乳，涡旋5 min混匀，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，涡旋5 min混匀，室温静置15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.2.5 经预处理的空白脂质体溶液 精密量取“2.1”项下空白脂质体 100 μL，加入800 μL甲醇破乳，涡旋5 min混匀，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，涡旋5 min混匀，室温静置15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.2.6 经预处理的空白脂质体+米索硝唑溶液 精密量取“2.1”项下空白脂质体+米索硝唑100 μL，加入800 μL甲醇破乳，涡旋5 min混匀，加入50 mg/mL ZnCl2甲醇溶液100 μL，涡旋5 min混匀，室温静置15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，即得。

2.3 UV法测定脂质体中主成分的含量

2.3.1 专属性试验 （1）未经预处理样品。取“2.2”项下对照品溶液、辅料溶液、未经预处理的空白脂质体溶液各适量，于200～400 nm波长范围内扫描，光谱图见图1（图中PE为磷脂酰乙醇胺，LA为亚油酸，VE为维生素E，CHO为胆固醇，CMC为羧甲基壳聚糖）。由图1可知，米索硝唑在322 nm波长处有最大吸收；但辅料磷脂酰乙醇胺在322 nm波长处也有较大吸收，即对主成分测定有很大干扰，而辅料胆固醇、亚油酸、维生素E、羧甲基壳聚糖在322 nm波长处无明显吸收，即对主成分测定无明显干扰；未经预处理的空白脂质体在322 nm波长处亦有较明显的紫外吸收，即此时无法消除磷脂酰乙醇胺对主成分测定的干扰。

（2）经预处理样品。取“2.2”项下经预处理的空白脂质体溶液、空白脂质体+米索硝唑溶液、米索硝唑pH敏感脂质体溶液各适量，于200～400 nm波长范围内扫描，光谱图见图2。由图2A可知，经预处理完全沉淀了辅料磷脂酰乙醇胺，空白脂质体在322 nm波长处无明显的紫外吸收；由图2B、C可知，米索硝唑的最大吸收峰仍出现在322 nm波长处，因而此时辅料对主成分的测定已无干扰。

2.3.2 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液10、20、40、80、160、320 μL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成系列对照品溶液。以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度。以米索硝唑质量浓度（c，μg/mL）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标进行线性回归，得米索硝唑回归方程A＝0.032 8c－0.008（r＝0.999 6）。结果表明，米索硝唑检测质量浓度线性范围为0.96～30.72 μg/mL。

图1 未经预处理样品的紫外吸收光谱图Fig 1 UV absorption spectra of untreated sample

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，分别加甲醇制成低、中、高质量浓度（3.84、7.68、15.36 μg/mL）对照品溶液，以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度，连续测定6次。结果，米索硝唑吸光度的RSD分别为0.93%、0.62%、0.48%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.2.4”项下经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液适量，分别在室温下放置0、2、4、6、12 h时，以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度。结果，米索硝唑吸光度的RSD为0.91%（n＝5），表明经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

2.3.5 重复性试验 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，共6份，按“2.2.4”项下方法制备经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液。以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度并计算主成分的含量。结果，米索硝唑含量平均值为99.20%，RSD为1.55%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，共9份，按“2.2.4”项下方法制成低、中、高质量浓度的米索硝唑pH敏感脂质体溶液。以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度并计算回收率，结果见表1。

2.3.7 米索硝唑pH敏感脂质体中主成分的含量测定 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，按“2.2.4”项下方法制备经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液。以甲醇为空白，于322 nm波长处测定吸光度并计算含量。平行测定3次。结果，3次测得的米索硝唑含量分别为99.86%、100.16%、100.32%（RSD＝0.56）。

图2 经预处理样品的紫外吸收光谱图Fig 2 UV absorption spectra of treated sample

表1 UV法回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests for UV（n＝9）

2.4 HPLC法测定脂质体中主成分的含量

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：322 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.4.2 专属性试验 取“2.2”项下对照品溶液、空白脂质体溶液、经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液和经预处理的空白脂质体+米索硝唑溶液各适量，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图3。由图3A可知，米索硝唑出峰时间为6.075 min；由图3B可知，经预处理的空白脂质体已基本除去干扰主成分测定的辅料磷脂酰乙醇胺；由图3C、D可知，经预处理的空白脂质体+米索硝唑和米索硝唑pH敏感脂质体药物结构及极性未受影响，主成分出峰时间一致。

图3 高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms

2.4.3 线性关系考察 分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液5、10、20、30、40、50 μL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成系列对照品溶液。精密量取上述系列对照品溶液各20 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以米索硝唑质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得米索硝唑回归方程y＝56.82x－5.36（r＝0.999 5）。结果表明，米索硝唑检测质量浓度线性范围为0.48～4.80 μg/mL。

2.4.4 定量限与检测限考察 分别精密量取“2.2.1”项下对照品溶液适量，以甲醇倍比稀释，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10∶1、3∶1分别计算定量限、检测限。结果，米索硝唑的定量限、检测限分别为0.23、0.08 μg/mL。

2.4.5 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，米索硝唑峰面积的RSD为1.08%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取“2.2.4”项下经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液适量，分别在室温下放置0、2、4、6、12 h时，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，米索硝唑峰面积的RSD为1.55%（n＝5），表明经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

2.4.7 重复性试验 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，共6份，按“2.2.4”项下方法制备经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算主成分的含量。结果，米索硝唑含量平均值为99.60%，RSD为1.38%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.4.8 回收率试验 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，共9份，按“2.2.4”项下方法制成低、中、高质量浓度的米索硝唑pH敏感脂质体溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表2。

表2 HPLC法回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests for HPLC（n＝9）

2.4.9 米索硝唑pH敏感脂质体中主成分的含量测定 取“2.1”项下米索硝唑pH敏感脂质体适量，按“2.2.4”项下方法制备经预处理的米索硝唑pH敏感脂质体溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件进样测定并计算主成分的含量。平行测定3次。结果，3次测得的米索硝唑含量分别为99.95%、99.98%、100.05%（RSD＝0.46）。由此可见，米索硝唑pH敏感脂质体经预处理后，采用UV法和HPLC法所测得的主成分含量之间无明显差异。

3 讨论

在对制剂进行质量控制时，选择合适的检测方法是关键，既要准确、可靠，又要方便、快捷。通常，对有紫外吸收的成分，其含量测定的首选方法是UV法或HPLC法[11]。由于2015年版《中国药典》未收录米索硝唑及其制剂，因此，对米索硝唑及其制剂中主成分的含量测定方法没有现行的标准。

参照文献[12]报道，米索硝唑的最大吸收波长为320～325 nm。本试验通过紫外光谱扫描确定米索硝唑最大吸收波长为322 nm，而其pH敏感脂质体中的辅料磷脂酰乙醇胺在此波长下有明显干扰。磷脂分离方法包括有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、乙酰化法、柱层析法、膜分离法、金属离子沉淀法等[13]，其中金属离子沉淀法操作简单，即通过重金属离子与磷脂酰乙醇胺结构中的羧基或胺基强力结合，使其沉淀并可通过离心除去，不影响主成分的测定，更适合本研究。常用的金属离子沉淀剂包括CoCl2、ZnCl2、NiCl2等。本课题组通过预试验对比发现，ZnCl2反应条件温和，不与主成分反应，不干扰主成分的紫外吸收，更适合本研究。采用ZnCl2预处理后的脂质体溶液中经HPLC法分析证实已无磷脂酰乙醇胺存在，从而消除了其对主成分含量测定的干扰。

综上所述，UV法结合金属离子沉淀法操作简便、准确，精密度、稳定性、重复性好，可用于米索硝唑pH敏感脂质体中主成分的含量测定，其结果与HPLC法含量测定结果一致。