白细胞内IRE1αlpha-XBP1信号通路控制前列腺素的生物合成进而参与对痛觉的调控

一、研究背景

内质网(ER)的功能是保证分泌蛋白和跨膜蛋白的正确折叠以及翻译后修饰。而在多种生理或病理情况下会引起错误折叠蛋白在内质网内的堆积，继而引起内质网应激并诱发未折叠蛋白反应(UPR)。IRE1αlpha-XBP1信号通路是UPR中进化最为保守的一个分支。当ER稳态发生改变时，双酶IRE1αlpha经过寡聚化和自身磷酸化，进而激活其内切核糖核酸酶结构域，从未剪接的XBP1 mRNA中切除26个核苷酸片段，这种非常规剪接直接释放出功能型转录因子XBP1，后者能够促进多个具有控制内质网蛋白折叠能力基因的表达。大量证据表明IRE1αlpha-XBP1信号也可控制非UPR依赖的细胞内通路，进而影响肝内脂肪生产、低氧反应、血管生成、动脉粥样硬化、关节炎以及抗肿瘤免疫等过程。通过质膜上的Toll样受体(TLRs)，髓系白细胞选择性地快速激活IRE1αlpha-XBP1通路，对产生适量的促炎细胞因子是很必要的。然而在炎症状态下，白细胞内由IRE1αlpha-XBP1通路调控的精准转录和代谢过程及其生理结果还很不清楚。

二、主要研究结果

1.IRE1αlpha通路控制髓系白细胞通过模式识别受体(PRR)而诱发的转录过程

为了研究IRE1αlpha-XBP1通路激活如何影响髓系白细胞内广泛的基因表达，研究者们使用细菌脂多糖（LPS，TLR4激动剂）和真菌酵母多糖（Dectin-1和TLR2激动剂）刺激野生型(WT)以及IRE1αlpha缺陷的骨髓来源的树突细胞(BMDCs)，并进行无偏好转录分析。结果与以前的报道一致，受到以上微生物产物刺激的WT-BMDCs出现了依赖IRE1αlpha的Xbp1剪接体，而不是在ER应激反应中应该出现的常规XBP1靶基因的强劲诱导表达或其他UPR分支的激活。用LPS 或酵母多糖刺激后，没有出现IRE1αlpha依赖的调节性衰退(RIDD)迹象，因为已报道过的、在此过程中应该被调节表达的几个基因并没有在IRE1αlpha缺陷的BMDCs中出现明显表达。尽管IRE1αlpha缺陷不影响粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激下的BMDC繁殖与存活，但分别用LPS和酵母多糖刺激IRE1αlpha缺陷的BMDCs时，发现与WT-BMDCs比较分别有1792和2863个基因发生了显著性表达改变，二者中有1167个基因相同，表明这1167个基因发生明显表达改变的效应是不依赖特异激动剂、而是依赖IRE1αlpha缺陷的共同效应。经灵巧路径分析(IPA)，可以把这1167个基因通过富集(Enrichment)分成九个生物类别。正如研究者所期望的，在IRE1αlpha缺陷影响其转录的靶基因中，有调控蛋白翻译后修饰和维持细胞存活的基因。令研究者感到惊喜的发现是，在BMDCs受LPS或者酵母多糖刺激后，花生酸类物质的生物合成和代谢是受到IRE1αlpha调节的主要细胞功能。研究者们又进一步确定了27个调节因子，不仅其本身mRNA水平的表达有显著改变，并且能够调控大量的其他已知靶基因。同时证实了之前的报道，与WT-BMDCs相比，IRE1αlpha缺陷的 BMDCs在通过TLR刺激后，Il6及其相关靶基因的表达都出现显著的下调。此外，Ptgs2/Cox-2和Ptges/mPGES-1作为潜在的类花生酸类物质代谢的调节因子，在LPS或酵母多糖刺激后的IRE1αlpha缺陷的BMDCs中出现了明显下调，这与IPA分析结果所预示的相一致。研究者们也分别用RT-PCR和Western bolt实验进一步证实，在受到刺激的、IRE1αlpha缺陷的BMDCs中，以上两个调控因子在mRNA和蛋白水平均出现下调。但IRE1αlpha缺陷不影响组成型的Ptgs1/Cox-1或Ptges2/mPGES-2基因表达，表明这种内质网应激感受器的主要功能是介导Ptgs2/Cox-2和Ptges/mPGES-1的快速诱导表达。综合以上实验结果，研究者们认为IRE1αlpha是髓系白细胞生成类花生酸类物质所必需的。

2.IRE1αlpha-XBP1信号为正常前列腺素生物合成所必需

前列腺素是类花生酸类物质中的主要成员之一，它的生物合成依赖于Cox-2对花生四烯酸的快速代谢。这种具有生物活性的脂类参与多种生理过程，如过敏反应、发热、血管通透性和疼痛等。尽管脂质分析显示IRE1αlpha缺陷不影响未受刺激的BMDCs分泌基础水平的前列腺素，但与WT-BMDCs相比，IRE1αlpha缺陷的BMDCs在受LPS刺激后，细胞内的一些前列腺素如PGE1,PGF1a,PGD2,PGE2,PGF2a,15-keto PGF2a,D12-PGJ2,13,14dh-15k PGE2和 PGD3的水平出现显著地持续下调，这与Cox-2的诱导生成受损相一致。

Cox-2可将花生四烯酸转化为前列腺素内过氧化物H2(PGH2)，后者被mPGES-1进一步代谢成强效的脂质介质PGE2。与LPS刺激后IRE1αlpha缺陷的BMDCs内Cox-2和mPGES-1的生成减少相一致的是，与WT-BMDCs比较，RE1a缺陷的BMDCs内PGE2的生成也明显减少。其他缺乏IRE1αlpha的髓系白细胞亚群，如初级中性粒细胞和巨噬细胞，在LPS刺激后也表现为PGE2合成缺陷。为进一步在体验证以上发现，研究者们对白细胞内IRE1αlpha选择性缺陷的转基因鼠(Ern1f/f Vav1cre)给予LPS腹腔注射，随后用RT-PCR法原位定量分析PGE2的生成。LPS刺激可诱发腹膜白细胞内Xbp1的剪接以及后续依赖IRE1αlpha的Ptgs2和Ptges的生成。因此与WT组鼠相比，白细胞内缺乏IRE1αlpha鼠在LPS刺激后，腹膜来源的PGE2减少。通过一种独立的激动剂来验证前面转录组学的实验结果，发现IRE1αlpha缺陷的BMDCs在酵母多糖刺激后，PGE2的合成也减少。类似的结果也在腹腔注射酵母多糖的白细胞IRE1αlpha缺陷的小鼠在体实验中得到证实。脂质体分析进一步发现，与Ern1f/f鼠比较Ern1f/fVav1cre鼠的无细胞腹腔灌洗液中依赖Cox-2合成的前列腺素（PGE2，PGD2和 PGF2a）和TBX2明显减少，与之成鲜明对照的是脂氧合酶依赖的15-HETE合成则未受到影响。XBP1缺陷与IRE1αlpha缺陷髓系白细胞的表型相同，而消融内质网其他应激感受器如PERK（Eif2ak3所编码）和ATF6a，在LPS或酵母多糖刺激后，并未表现出PGE2的生成减少。因此白细胞选择性的需要IRE1αlpha-XBP1通路以保证在受LPS或酵母多糖刺激时产生足量的PGE2。

用其他质膜结合的TLRs的激动剂处理BMDCs，也观察到了IRE1αlpha依赖的PGE2诱导生成，但激活核内的TLR3,TLR8或TLR9均无此作用。以上结果与之前报道相一致，即IRE1αlpha-XBP1通路可以被质膜结合的TLRs激动剂显著激活，而核内TLRs的激活并无此作用。用佛波酯(PMA)处理IRE1αlpha缺陷的BMDCs，其PGE2的生成也出现下调，此结果排除了IRE1αlpha缺陷导致TLR信号通路受损的可能性。此外，研究者还发现应用内质网应激激动剂—毒胡萝卜素处理IRE1αlpha缺陷的BMDCs，其PGE2的生成也下调，与之相应的是Cox-2和mPGES-1表达的也下调。综合以上实验结果，小鼠髓细胞经内质网应激或刺激质膜结合的TLRs引起的PGE2适量合成需要IRE1αlpha-XBP1通路的激活，后者促进了Cox-2和mPGES-1的表达。

为进一步明确IRE1αlpha-XBP1通路是否能够控制人髓系白细胞内PGE2的生成，实验者从健康志愿者的外周血中取得单核细胞来源的树突状细胞(DCs)，并通过基因编辑技术敲除IRE1αlpha-XBP1通路。原代人DCs经瞬时转染靶向XBP1的单导RNA (SgRNA)-Cas9复合体可有效地编辑该基因，并在酵母多糖处理后有效阻止了其活性转录形式的生成。与转染了打乱sgRNA-Cas9复合体（对照）的WT-DCs相比较，酵母多糖处理XBP1缺陷 的人DCs后，PTGS2和PTGES的诱导生成以及PGE2的产生都明显减少。类似的结果也在转染了靶向ERN1复合体的人DCs中观察到。以上实验表明，诱导PGE2生成的、保守的IRE1αlpha-XBP1通路在人DCs得到证实。

3.XBP1s反式激活人PTGS2和PTGES启动子

为了研究人白细胞中IRE1αlpha激活的XBP1(XBP1s)调控PGE2生成的分子机制，研究者分析了PTGS2和PTGES的启动子区域，即XBP1s可能的结合位点，并在PTGS2启动子上找到了前人所预测的X-box结合和未折叠蛋白反应元件A (UPRE-A)序列。此外，还在PTGES启动子中识别出一个X-box结合区和两个ETS结构域结合位点。所以，实验者假设XBP1可能是PTGS2和PTGES的转录驱动因子。

为了研究结合于已识别启动子区域的XBP1s，研究者运用了染色质免疫共沉淀(ChIP) -PCR技术。通过单独用酵母多糖或者同时应用酵母多糖和2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，可抑制N-连接蛋白糖基化）刺激人单核细胞来源的DCs，产生内质网应激并强力激活IRE1αlpha-XBP1通路。酵母多糖刺激促进了XBP1s结合于PTGS2和PTGES预测的启动子区域，若同时合用内质网应激激活剂2-DG刺激，可显著增强以上结合效应。用抑制剂MKC8866选择性失活IRE1αlpha的核糖核酸酶(RNase)结构域，则完全抑制了酵母多糖诱发的内质网应激的人DCs中的XBP1s与以上启动子区域的结合。XBP1s也可结合在GFPT1的启动子区域，然而缺乏XBP1结合位点的pri-miR-21的启动子区域在本研究中没有得到富集。此外，用人胚肾(HEK) 293细胞进行荧光素酶报告基因的实验表明，XBP1s能剂量依赖性反式激活人PTGS2和PTGES启动子。相反，PERK控制的ER应激转录因子CHOP在此报告系统中没有受到影响。以上研究表明，IRE1αlpha激活的XBP1s通过直接驱动PTGS2和PTGES的转录诱导进而促进PGE2的生物合成。

4.白细胞内IRE1αlpha-XBP1通路促进疼痛行为

由Cox-2和mPGES-1诱导产生的PGE2与外周感觉神经元和中枢神经系统中的EP1-4受体结合后促进疼痛反应。研究者认为在白细胞内缺乏IRE1αlpha的小鼠，由于合成PGE2的功能受损，会减轻在炎性刺激下的疼痛行为。研究者采用了两种经典PGE2依赖的疼痛模型：醋酸诱发的内脏痛模型和足底切口的术后疼痛模型。Ern1f/f和Ern1f/f Vav1cre鼠经腹腔注射0.9% (v/v)的乙酸后，双盲监测实验鼠的30分钟内扭体行为发现，与Ern1f/f鼠比较IRE1αlpha缺陷的Ern1f/f Vav1cre鼠的扭体次数以及无细胞腹腔灌洗液中的PGE2水平均明显降低。自动化的无偏向和双盲实验用来评估醋酸引起的炎性内脏痛如何影响实验鼠的正常运动能力。与Ern1f/f Vav1cre鼠相比，Ern1f/f鼠的运动能力下降，表现为注射醋酸之后总体移动次数和运动时间减少。同时，白细胞缺陷XBP1鼠(Xbp1f/f Vav1cre)也出现扭体行为的减少，据此可以确认经典的IRE1αlpha-XBP1通路介导了此类痛反应。腹腔白细胞内组成型（与诱导型相对应）IRE1αlpha依赖的XBP1剪接体在给醋酸后维持上调，但在IRE1αlpha缺失的白细胞中，Ptges表达比正常时降低了约50%。在相同时间点进行比较分析，发现IL-1β，IL-6和TNF-α 的表达无论在mRNA水平还是蛋白水平均未发生明显改变。表明在受醋酸刺激时，白细胞内部的IRE1αlpha可在不影响其他促炎因子合成分泌的情况下，能够快速生成PGE2。IRE1αlpha介导的扭体反应在雌鼠和雄鼠的表现类似，表明性别对该表型无影响。研究者又分别使用IRE1αlpha的两种抑制剂：激酶结构域特异性抑制剂KIRA6和核糖核酸酶结构域特异性抑制剂MKC8866，用药理学方法抑制IRE1αlpha-XBP1通路观察是否可以减轻炎性内脏痛。分别在腹腔注射醋酸前6 h和30 min进行腹腔给予KIRA6及MKC8866，实验结果显示两种抑制剂均可以减少腹腔白细胞内的Xbp1s和Ptges表达，并且显著减少实验鼠的扭体次数。应用相似剂量的塞来考昔（Celecoxib，一种通过抑制Cox-2从而限制前列腺素产生的非甾体类抗炎药）也可以明显减少实验鼠扭体次数，进一步证实PGE2在这一痛反应中的作用。以上结果表明，激活IRE1αlpha-XBP1通路促进了醋酸诱发的内脏痛。

接下来，研究者又研究了白细胞内的IRE1αlpha缺陷是否影响术后疼痛，其由PGE2介导，一般情况下用Cox-2抑制剂对其进行治疗。分别在Ern1f/f和Ern1f/f Vav1cre鼠右后脚掌予手术切口，在不同时间点监测其非反射性痛行为，并与术前基础值进行对比分析。术后24 h，在损伤部位分离出的CD45+白细胞中发现了IRE1αlpha依赖的Xbp1剪接体。尽管此时中性粒细胞、巨噬细胞和DCs浸润病损部位的比例没有发生改变，但发现在Ern1f/f Vav1cre鼠浸润切口部位，表达Cox-2的白细胞数量显著减少（与Ern1f/f鼠比较）。承重分布实验研究表明，与Ern1f/f鼠比较 IRE1αlpha缺陷的Ern1f/f Vav1cre鼠表现出更好的使用伤足的能力，它们在手术后的早期阶段表现出更为平衡的后爪承重分布，并且术后恢复也更快，这一表型与两种鼠的体重无关。在Ern1f/f Vav1cre鼠，自发痛行为如面部表情评分和防御评分也明显降低。用von Frey测定的机械痛阈值在Ern1f/f鼠和Ern1f/f Vav1cre鼠之间无统计学差异，这与先前报道在急性痛啮齿动物模型中的外周Cox-2在诱发的机械敏化中的作用可以忽略不计相一致。Ern1f/f鼠和Ern1f/f Vav1cre鼠术后甩足次数及足底周长也无明显差异。性别对比发现白细胞内源性IRE1αlpha在这些术后反应中的作用在雌雄不完全相同，如Ern1f/f Vav1cre鼠雄与Ern1f/f雄鼠比较，表现出的受损程度更轻、恢复更快，而雌鼠中没有发现这种差异。

为研究IRE1αlpha是否可以作为药靶而调节术后疼痛，在术前给予小鼠注射MKC8866，结果发现IRE1αlpha抑制剂能够改善伤害性功能，表现为与溶剂对照组相比承重分布更加均衡，给予MKC8866小鼠的面部表情评分及防御评分均出现显著降低。但与在Ern1f/f Vav1cre鼠的实验结果有所不同，MKC8866组鼠的甩足活动减少，表明其他非白细胞中的IRE1αlpha也有致痛作用。MKC8866组鼠的饲养活动改变不明显，表明若想使雄鼠术后表现出特定行为变化，可能需要对IRE1αlpha的完全抑制才行。与IRE1αlpha敲除鼠的实验结果相同，MKC8866组鼠的机械痛敏不变。类似的实验结果也在给予KIRA实验鼠上观察到。作为阳性对照的Celecoxib，与抑制IRE1αlpha的结果相似，即与溶剂对照组相比，Celecoxib鼠在术后表现出更加平衡的承重分布、面部表情评分及防御评分均较低，而甩足、饲养活动和机械痛敏无明显改变。这与先前的报道一致，即在可比剂量下，Cox-2抑制剂不影响急性痛的机械痛敏。以上结果表明，在两种不同的PGE2依赖性疼痛模型中，白细胞中IRE1αlpha-XBP1通路缺陷或受抑制小鼠的疼痛反应行为降低，表明IRE1αlpha可作为在体治疗以上类型疼痛的药理学靶标。

三、主要结论

本研究在分子水平和功能水平揭示了内质网应激感受器IRE1αlpha作为前列腺素生物合成和小鼠疼痛反应的重要媒介。表明IRE1αlpha激活转录因子XBP1以维持Cox-2和mPGES-1的表达，这两种限速酶是生成适量的前列腺素所必需的，这是一种以前未被重视的新机制。临床上，特别是在目前面临阿片类药物滥用危机的美国，需要更加有效的疼痛治疗药物。IRE1αlpha-XBP1信号的药理学调节可能代表了疼痛治疗一种新方法，具有更好镇痛效果、减少阿片类药物需求和减少阿片类药物不良反应的潜力。后续的研究应着眼于IRE1αlpha-XBP1信号通路是否调节其他受前列腺素影响的病理生理过程，如怀孕、发热、过敏以及肿瘤免疫抑制等。