疼痛性别差异的表观遗传学研究进展*

薛艳芝 鲁显福 胡啸玲△ 王佑陵

（1南华大学附属第一医院麻醉科，衡阳 421001；2安徽医科大学附属第一医院高新院区麻醉科，合肥 230031）

疼痛一直以来都是困扰人类的难题，机制尚不完全清楚，现有的治疗方法还不能有效解决这个复杂临床问题。人类的流行病学调查表明女性与男性疼痛相比患病率更高、疼痛更甚且持续时间更长，包括偏头痛、肠易激综合征、纤维肌痛、复杂性区域疼痛综合征、风湿痛、颞下颌关节紊乱和盆腔痛等[1,2]。性别差异是个体化医疗的一部分，这意味着在两性中，疾病治疗的最佳疗法可能会有所不同。既往认为存在性别差异的生物学机制包括性激素水平、性染色体、内源性镇痛系统（μ/κ-阿片受体等）、免疫、疼痛相关的受体及递质（如配体门控离子通道型嘌呤受体(ATP-gated ion channels purinergic receptors,P2XR)以及大脑结构和功能等生物因素以及抑郁焦虑等精神疾病和女性社会功能角色的特殊性等社会心理因素[3,4]。而最新研究发现，表观遗传机制可以在分子水平调节疼痛反应，参与疼痛发展的性别差异。表观遗传学调控证明了环境和生活方式对机体生物过程的影响，包括X染色体失活、DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)的表达等。目前，人类疼痛性别差异表观遗传学的科学尚处于早期阶段。本文综述疼痛中存在性别差异的表观遗传修饰的最新进展，这些发现对治疗疼痛具有积极意义，它更好地阐明疼痛机制，利于其靶向治疗。本文创新之处为，以性别差异为出发点，从X染色体失活、DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA表达等领域较全面地探讨疼痛差异的表观遗传学机制，有望为研究疼痛机制及其靶向治疗开辟一条新的途径。

一、表观遗传学现象

表观遗传是指不改变实际DNA序列，基因表达发生改变且可以遗传。它们是环境因素与细胞内遗传物质之间发生交互作用产生，可以影响生理和病理过程[5]。表观遗传修饰包括X染色体失活、DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA的表达等。

雌性哺乳动物含有XX染色体，而雄性则含有XY染色体，为了保持性染色体连锁基因表达剂量的平衡（剂量补偿），就有了X染色体失活(X-chromosome inactivation,XCI)。它是通过对雌性的一条X染色体随机失活的方式对X连锁的基因表达进行调控来实现的。目前对X失活机制的研究表明，它并不是随机的，而是X染色体上的失活中心(X-chromsome inactivation center,XIC)通过表达的长链非编码RNA对所在染色体进行顺式调控，有关X染色体失活机理可能是引起疾病、衰老以及性别差异的原因[6,7]。

DNA甲基化主要是共价修饰胞嘧啶残基，主要作用位点为胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶。CpG位点分布在整个DNA序列中，包括启动子、基因体和转座因子的组织特异性功能的差异甲基化区域(differentially methylated region,DMR)[8]。基因调控序列（如启动子或增强子）上DNA甲基化可以抑制基因表达。这种抑制是由一个甲基群识别蛋白系统完成的，该系统招募特定的编程因子来生成一个封闭的染色质结构，从而使转录机制难以访问该基因，使基因表达降低。

在细胞核中，大多数基因组DNA是由H2A、H2B、H3和H4各两分子组成的组蛋白八聚体周围紧密压实，通过接头H1组蛋白加连接体DNA连接成核小体。该结构维持基因组的稳定性并防止其他核蛋白质进入基因组DNA。在活细胞中，核小体通过核蛋白与核心组蛋白的N末端尾部内的特定残基的翻译后修饰(posttranslational modification,PTM)进行动态重构，涉及乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化等。通常，组蛋白乙酰化和磷酸化增加转录，而组蛋白甲基化可以沉默或增加基因表达[9,10]。

ncRNA是不编码蛋白质的RNA。它们根据其大小和功能进行分类，主要成员包括微核糖核酸(microRNA,miRNA)和长链非编码核糖核酸(long ncRNA,lncRNA)。miRNAs含有20～24个核苷酸，转录后通过mRNA降解或抑制翻译来抑制蛋白质表达。miRNAs是很小（21～23个核苷酸）的单链RNA分子。 miRNA不被翻译成蛋白质但具有调节功能。 miRNAs形成RNA诱导的沉默复合物，其可以通过激活降解mRNAs的内切核酸酶或通过阻断翻译来阻止蛋白质的表达[11]。miRNA与细胞分裂和死亡、细胞代谢、细胞内信号传导、免疫和细胞运动等生理过程相关。因此，miRNA表达改变可影响这些关键过程，并因此导致各种病理性的不良结果。lncRNAs长于200个核苷酸，可通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用干扰转录和转录后过程。

二、疼痛性别差异的表观遗传学

1.X染色体失活

女性中两条基本相同的X染色体之一上约一千个基因的失活是众所周知的表观遗传学基因沉默机制之一。在人类中，约15%的X连锁基因从XCI中逃逸。逃逸基因存在个体差异和组织特异性。因此，从XCI逃逸不仅会导致男性和女性之间的表达差异，而且会导致女性之间的组织表达差异。这可能对男女之间或女性之间的疾病差异具有重要意义。XCI与其他表观遗传学机制存在密切的互交联系[12]。组蛋白去甲基酶kdm6a是XCI中逃逸基因所编码的酶， Kdm6a以去甲基酶酶活性依赖性方式通过在启动子处使组蛋白H3赖氨酸第27位三甲基化(tri-methylation at lysine 27 of histone H3,H3K27me3)去甲基化来促进白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)表达。Kdm6a也促进β干扰素(interferon-beta,IFN-β)表达。IL-6是重要的细胞因子，参与炎症以及免疫应答及调节。IFN-β参与抗病毒及免疫调节。逃逸基因性别差异导致其所编码的kdm6a表达发生改变，其在雌性中的表达水平高于雄性[13]。这些研究便于我们更好地理解在炎症和自身免疫疾病（如类风湿性关节炎，多发性硬化症，复杂性区域疼痛综合征等）疼痛中存在的性别差异。

2.DNA甲基化

瞬时受体电位锚蛋白1 (transient receptor potential anchoring protein 1,TRPA1)是一种重要的转导分子，在伤害性感觉神经元中的表达可调控疼痛敏感性。单基因双胞胎的全基因组甲基化分析发现TRPA1启动子中CpG二核苷酸的甲基化与热诱发疼痛的阈值呈负相关[14]。TRPA1介导感觉传入神经的机械敏感性和压力诱发的疼痛。分析了75名健康志愿者的全血样品中的TRPA1基因启动子区域中47个CpG位点的甲基化状态，发现影响热诱发疼痛阈值的CpG位点在压力疼痛阈值较低的受试者中是超甲基化的，并且还存在性别差异，女性与男性相比，甲基化率更高，压力疼痛敏感性也更高[15]。

纤维肌痛 (fibromyalgia,FM) 以慢性广泛疼痛、疲劳和认知/情绪障碍为特征，女性多见。研究发现女性纤维肌痛病人与差异性甲基化相关，这些相关的甲基化位点包括脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、N-乙酰基转移酶15 (N-acetyltransferase15,NAT15)、组蛋白去乙酰化酶 4 (histone deacetylase4,HDAC4)、蛋白激酶 C-α(protein kinase C,alpha,PRKCA)、浆膜蛋白1 (reticulon1,RTN1) 和cGMP依赖性蛋白激酶1 (cGMP-dependent protein kinase 1,PRKG1)[16]。

3.组蛋白修饰

组蛋白修饰在表观遗传调控中起着重要的作用。组蛋白甲基转移酶G9a，又称为常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2 (euchromatic histone lysine N-methyltransferase 2,Ehmt2)，由Ehmt2基因编码，是常染色质主要的甲基转移酶之一，可以甲基化组蛋白H3赖氨酸第9位(histone 3 lysine 9,H3K9)、组蛋白H3赖氨酸第9位(histone 3 lysine 27,H3K27)和组蛋白H1b赖氨酸第26位(histone 1b lysine 26,H1bK26)等。此外，G9a也可以直接甲基化一些非组蛋白，并与DNA甲基化密切相关。G9a功能紊乱可以导致疼痛的发生发展[17]。慢性疼痛时，G9a是抑制基因转录重要的表观遗传标志蛋白。甲基化CpG结合蛋白2 (methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)是一种转录阻遏蛋白，MeCP2通过与DNA中的甲基-CpG位点结合，募集G9a等转录因子形成复合体，来抑制特定基因的转录[18]。周围神经损伤后4周小鼠背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)中也发现MeCP2表达增加[19]。MeCP2在全脑再分布的变化也可直接或间接调节DRG中基因表达[20]。MeCP2会抑制转录抑制因子组蛋白二甲基转移酶G9a，导致杏仁核中央核(central nucleus of the amygdala,CeA)中G9a催化的产物H3K9me2减少并且脑源性神经营养因子(BDNF)的表达增加。在CeA局部采用病毒载体介导的MeCP2过表达，环化重组酶(cyclization recombination enzyme,Cre)诱导的G9a敲低以及给予BDNF可以延长疼痛效应。敲除小鼠MeCP2后，小鼠CeA中G9a及H3K9me2表达水平升高，痛阈升高。这些表明，在杏仁核MeCP2直接抑制G9a，可以调节对疼痛和阿片类药物奖赏的情绪反应[21]。MeCP2突变亦导致Rett综合征，这是一种X染色体连锁的严重的渐进性神经发育紊乱，女性多见，这些病人表现出伤害感受受损。重要的是，Kurian等发现雄性大鼠杏仁核、腹内侧下丘脑(ventromedial hypothalamus,VMH) 内表达的MeCP2 mRNA和蛋白质明显少于雌性[22]。此外，G9a还显示甲基化编码μ阿片受体(µ-opioid receptor,MOR)基因的启动子，MOR被阿片样物质如吗啡激活。众所周知，吗啡耐受和镇痛作用均存在明显性别差异。 坐骨神经分支选择性神经损伤(spared nerve injury,SNI)模型诱导的MOR基因和蛋白质的下调与MOR基因启动子中高度富集的G9a产物组蛋白H3赖氨酸第9位二甲基化 (histone 3 lysine 9 dimethylation,H3K9me2) 相关。综上所述，我们有理由相信MeCP2/G9a所调节的表观遗传学改变可能是引起疼痛并且造成性别差异的原因之一。

17β-雌二醇 (17β-estradiol,E2)可以增强切除卵巢大鼠的结直肠扩张刺激时的内脏运动反应(visceromotor response,VMR)，且是由雌激素受体(estrogen receptor alpha,ERα)介导的[23]。有研究发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)可以减弱E2产生的这种反应，且脊髓背角的代谢型谷氨酸受体2 (metabolic glutamate receptor2,mGluR2) mRNA和蛋白增加。SAHA增加H3K9ac和ERα与代谢型谷氨酸受体2启动子区域的结合。反之，mGluR2 拮抗剂又可以逆转了SAHA对E2所致大鼠VMR的减弱作用[24]。总之，脊髓中HDACi/mGluR2可能介导减弱E2内脏敏感性的促伤害作用。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)是一类核激素转录因子，已成为临床前研究中疼痛的重要调节因子，因此成为治疗疼痛的重要靶点[11]。性激素调节PPARs的表达[25]。PPAR天然配体和合成激动剂具有抗炎作用。PPARα激动剂可以逆转雄性小鼠SNI诱导的异常性疼痛，但不能逆转雌性或阉割的雄性，而PPARγ激动剂可以逆转雌性的异常性疼痛，而不会逆转男性或睾丸激素治疗的雌性[26]。Downing等[27]的研究发现，HDACi葡萄籽原花青素提取物增强组蛋白乙酰化作用，且PPARα基因和磷酸化蛋白表达增加，PPARα活性增加，HCACi/PPAR途径可能是逆转雄性异常疼痛的机制。

肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一种以腹痛为主要症状之一的疾病，有明显的性别差异。 IBS的病因尚不清楚。表观遗传学认为怀孕期间母亲的生活方式和环境因素会影响后代的健康，研究表明慢性产前应激(chronic prenatal stress,CPS)表观遗传上调了Sprague-Dawley大鼠雌性后代腰段脊髓背角而非背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)上脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达，这与雌性后代内脏过敏(visceral hypersensitivity,VHS)相关，但与雄性后代无关。成年后再次暴露于异源性慢性应激会使VHS在雌性中的持续时间长于雄性。慢性产前应激BDNF的上调可能与在雌性CPS大鼠的脊髓背角中的Bdnf启动子IX的核心启动子区域(-95/-26)处的RNA Pol II与组蛋白H3乙酰化的显著增加以及组蛋白脱乙酰酶1明显降低有关[28]。

父系的生活方式和环境因素也会影响后代。Vassoler等[29]研究结果明， 用可卡因处理的雄性小鼠作为父系时，乙酰化组蛋白H3与内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex,mPFC)中BDNF启动子结合，增强其乙酰化水平，在雄性后代中BDNFm-RNA增加并显示出可卡因抗性表型，而雌性后代则不显示可卡因抗性表型。表明mPFC中BDNF启动子乙酰化与可卡因抗性相关，且成性二态。

4.非编码RNA(ncRNA)

研究观察到许多miRNA可以与X非活性特异性转录物(X inactive specific transcription,XIST)以及X染色体失活相关的长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)结合调控XCI。核转录因子Yin-Yang1 (YY1)是一种核转录因子，是miR-34a靶基因，具有多样复杂的生物学功能。YY1因其名称“阴阳”暗示，YY1可激活或抑制基因转录，具体取决于细胞所接受的刺激及其联系与其他细胞因子。 YY1通过直接结合其靶启动子并募集组蛋白和DNA修饰子来调节基因表达。炎症反应时，不论是女性人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)还是雌性小鼠巨噬细胞(J774A.1)中miR-34a被下调，其不仅可以通过直接作用于XIST，使XIST表达增加，而且可以通过作用于YY1，先使YY1下调，间接使XIST表达增加。miR-34a/YY1/XIST可调节炎症反应失调相关的疼痛如复杂区域疼痛综合征(complex regional pain syndrome,CRPS)[30]。

车祸后颈椎损伤是颈椎轴性痛的常见病因，女性多见，表现为单侧或双侧的颈项、后肩胛区的慢性钝痛，可伴有头晕、颈部僵直等。研究发现位于X染色体上的8个miRNA发生差异性表达，包括miR-532-5p，-501-5p，-500a-3p，-362-5p，-500b-5p，-502-3p，-20b-5p和let-7f-2-3p。X染色体这些miRNA在女性中的表达水平始终高于男性，可能与女性持续的严重轴性疼痛有关[31]。

免疫途径参与疼痛性别差异。雌性小鼠通过淋巴细胞处理机械性疼痛，但当淋巴细胞不存在时可以使用小胶质细胞依赖性途径[26]。脊髓背角小胶质细胞在雄性小鼠的疼痛超敏反应是必不可少，Toll样受体4 (Toll-like receptors,TLR4)由小胶质细胞表达，许多研究表明TLR4是雄性小鼠机械性疼痛超敏反应（异常性疼痛）所必需的。给予神经病理性疼痛和炎性痛的两性小鼠鞘内注射神经胶质抑制剂可以逆转雄性小鼠的这种疼痛，但不能逆转雌性小鼠[3,32]。此外，阻断参与小胶质细胞-神经元疼痛通路的几种信号传导介质，特别是P2X4受体，p38 MAP激酶或脑源性神经营养因子，可以逆转雄性的异常性疼痛[33]，但不能逆转雌性小鼠异常性疼痛[26,32]。研究表明，TLR4是miR-451的直接靶点，miR-451可以通过靶向TLR4抑制小胶质细胞激活介导的炎症来缓解雄性小鼠慢性炎症疼痛[34]。在坐骨神经慢性压迫性损伤(chronic constriction injury,CCI)后10天开始短期使用吗啡，延长了CCI机械性异常性疼痛的持续时间。这种致敏作用依赖于小胶质细胞反应性和TLR4信号传导，miR-124和miR-146a可以调节这种信号传导，两者均可以逆转吗啡诱导的持续致敏，并且在miRNA给药结束的数小时至数天内再次出现异常性疼痛[35]。综上所述，除了miR-451外，靶向TLR4的miRNA，抑制TLR4信号传导，可能逆转雄性的神经病理性疼痛。

NONRATT021972是一种lncRNA，参与伤害性信号传导。Liu等[36]研究发现在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠DRG中 lncRNA NONRATT021972、P2X7和 TNF-α表 达 增 加，且大鼠的机械性缩爪阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)、热缩足潜伏期值(thermal withdrawal latency,TWL)和尾神经感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity,SNCV)均增加，抑制NONRATT021972下调P2X7和TNF-α表达。已经有研究发现关节内抑制P2X7可明显减弱雌性大鼠膝关节滑膜炎的关节痛觉过敏和炎症[37]。NONRATT021972/P2X7R途径可能介导了疼痛的性别差异。

三、结语

在过去的20年或更长的时间里，人们意识到许多疾病在男性和女性中不同。虽然有大量关于疼痛性别差异的研究，但临床影响仍然不足，临床医生对于疼痛的治疗用药依旧很少考虑性别差异因素。与此同时，人们发现生物医学研究中的大多数实验对象在临床和临床前研究中都是雄性，对雌性的研究是不够的。这恰恰是由于实验者的社会偏见，他们往往选择雄性而不是雌性。在动物研究中，由于发情周期引起的变化，雌性被认为比雄性更易变。本文重要的是强调性别差异与疾病机制密切相关，研究者们更不应该漠视这种性别差异。综上所述，疼痛性别差异的表观遗传学因素参与疼痛调节，进一步研究其对治疗疼痛有积极的意义，值得研究者们予以更多关注。