常见癌痛动物模型的优缺点及在中医药中的应用*

张 震 税会利 陈志平 王镜辉 黄雯琪 杨 兵 杨 柱 唐东昕

（贵州中医药大学第一附属医院肿瘤科，贵阳 550002）

癌性疼痛在许多肿瘤病人中普遍存在，目前对于癌性疼痛的治疗依然以西医的癌痛三阶梯止痛原则为主[1]，其他治疗方法包括手术、放化疗等，但是西医的各种治疗方法不良反应较大，在治疗的同时也让病人痛苦不堪，近年来中医药在临床癌性疼痛的治疗中效果显著，目前研究显示，中医药治疗癌痛疗效确切，可显著改善病人症状，提高病人生活质量，且不良反应少。对于癌痛研究的关键是各种模型的建立，相应的动物模型是研究癌痛的基础。建立可靠的癌痛动物模型，将有利于研究癌性疼痛的基本作用机制，对开发治疗癌性疼痛的药物和方法具有重要意义。各种癌痛模型的建立也经过了漫长的探索与不断地革新，本文对目前常见的癌痛动物模型的造模方法、优缺点进行论述，希望为癌性疼痛的研究提供造模参考。同时对各种癌痛模型在中医药中的应用进行论述，为进一步开展中医药治疗癌性疼痛的机制研究奠定基础。

一、骨癌痛模型的发展

骨癌痛在癌痛中疼痛十分剧烈而且很难有效止痛。所以对骨癌痛研究最关键的是骨癌痛模型的建立。世界上第一个小鼠股骨癌痛模型于1999年被美国的Schiwei成功建立，随后其它部位的骨癌痛动物模型大量出现[2]。2002年Medhurst等成功构建胫骨癌痛模型[3]。现代研究发现，胫骨骨癌痛模型可视为转移性骨癌痛模型，因为胫骨骨癌痛动物表现出来的疼痛和临床的转移性骨癌痛表现相似。同时该模型疼痛检测方法简单，易于操作，是目前十分理想的研究骨癌痛动物模型。

二、胫骨骨癌痛模型的制备

目前对于胫骨癌痛模型的建立，癌细胞常选取Walker256乳腺癌细胞，动物选取普通雌性Wistar大鼠，将Walker256乳腺癌细胞注射到大鼠腹腔进行细胞培养，收集大鼠腹水，离心收集细胞[4]。参照Medhurst[3]等的方法建立模型。首先对大鼠进行腹腔注射麻醉。大鼠达到麻醉标准后，将其仰卧位固定于操作台上。将大鼠左侧小腿胫骨部位剃毛、消毒。切开胫骨下段小心暴露胫骨骨面。用直径为1 mm不锈钢转头进行打孔，但要防止打穿。然后用微量注射器将含有大鼠Walker256乳腺癌细胞的腹水注入骨髓腔，注射后迅速用骨蜡封闭钻孔处，用75%乙醇消毒伤口，伤口进行逐层缝合。整个操作严格遵守无菌操作。

关于骨癌痛模型的疼痛行为的检测方法[5～8]包括机械性痛觉过敏(randall-selitto test)，自发疼痛行为学改变、热痛觉过敏、机械性异常性疼痛(von Frey)。通过上述方法可对骨癌痛模型进行检测。

三、胫骨骨癌痛模型的优点和其注意事项及不足之处

目前胫骨骨癌痛模型所选择的细胞多来自自体接种大鼠产生的腹水瘤细胞，其来源相同，可直接进行腹腔注射。目前已经广泛用于各种动物模型的建立[9]。目前应用广泛的为Walker256细胞，其具有比较强的骨侵袭能力；而且细胞活力强，可在大鼠腹腔内大量增殖。对于手术方法也有改变，以往所采用的是胫骨平台入路，手术中对大鼠胫骨组织分离的程度很难把握，因此对术后的观察指标会造成很大的干扰。目前更多的采用胫骨中下段钻孔注入腹水瘤细胞，中下段胫骨皮肤较薄，无肌肉覆盖，很容易暴露骨头，创面小出血少，完成后为避免细胞外溢需要用骨蜡快速封闭创口。也可以选择用注射器针头进行钻孔，将10 μl注射器的针头弯成120。～150。让针尖尽可能多地进入骨髓腔，接种细胞后用骨蜡快速封闭钻孔处。骨癌痛模型的制备不足之处在于前期的细胞培养为体内培养，而不是通过培养基进行培养，其培养成本较高，培养周期较长。培养细胞使用的大鼠一般要选择离乳的幼鼠为最佳，周龄和体重过大对于细胞的培养会产生一定的影响。选择注射的腹水瘤细胞尽量避免选择含有血性腹水的细胞，大量研究表明血性腹水的细胞注射到骨髓腔内后，大鼠死亡率较高[10]。此外造模时需要制备者有一定的外科水平，对骨的解剖结构和骨科手术有一定的临床经验，初学者以及没有外科基础者需要反复进行实验才能熟练掌握。有文献表明骨癌痛模型大鼠在造模后28天左右多死于恶液质[10]。因此对于一些口服中药止痛的观察可能会因为灌胃周期较短而不能有效观察中药的止痛效果及中药制剂治疗癌性疼痛的机制。此外胫骨骨癌痛模型并不能代表所有骨癌痛，其它部位的骨癌痛模型也需要进一步的研究探索。

四、骨癌痛模型在中医药的广泛应用

中医药在治疗骨癌痛方面具有独特的优势，其方法多样，副作用小，作用持久，临床应用广泛。但是对于中药治疗癌痛的作用机制研究较少。王玉等[11]在成功建立骨癌痛动物模型基础上，研究乳腺癌术后骨转方对癌痛大鼠疼痛行为及脊髓星形胶质细胞的影响，结果表明乳腺癌术后骨转方的镇痛机制可能是通过抑制脊髓水平星形胶质细胞GFAP、SP、CGRP的表达发挥止痛作用。付桃芳等[12]在成功建立骨癌痛动物模型基础上，对模型大鼠连续腹腔注射吗啡治疗，11天后成功建立癌痛大鼠吗啡耐受模型。通过观察吗啡治疗前后应用电针治疗骨癌痛的效果，研究发现电针治疗可以延长癌痛大鼠吗啡耐受形成的时间，对于已经产生耐受的骨癌痛大鼠，电针治疗可以部分逆转耐受，恢复吗啡对骨癌痛大鼠的治疗效果。骨癌痛动物模型的建立对于中医药在骨癌痛治疗的机制和新药的研究提供了良好的研究工具。

五、化疗痛模型的优缺点及应用

化疗药物诱导的神经病理性疼痛，简称化疗痛[13]。其疼痛机制和药物的神经毒性有关。其化疗痛动物模型的建立方法通常是将化疗药物注射到动物体内，使之产生痛觉过敏反应。化疗痛模型的制备和骨癌痛模型相比，其制备方法简单可行，而且制备经济成本低。不需要进行细胞培养。而且化疗痛模型一般形成的机械或热痛觉过敏十分稳定，对于化疗痛的机制研究和抗癌痛药物的筛选具有重要的意义。但是通过各种化疗药物构建的化疗痛癌痛模型也存在一定的不足之处。如通过长春新碱构建的癌痛模型产生的痛觉过敏和痛觉异常和剂量有关，而且如果持续腹腔注射长春新碱会导致模型老鼠运动功能障碍和较高的死亡率，因此该模型的应用在一定程度上受到了限制。而且随着各种新型化疗药物的研发和应用。新型化疗药物癌痛模型的构建仍需深入的研究。目前的化疗痛模型大多是神经病理性疼痛模型，化疗引起的内脏痛和骨痛动物模型至今尚未成功构建。

目前，化疗痛的机制尚不明确，国内外均尚未发现有效的药物和方法能预防或控制这一并发症。因此化疗痛的发病机制以及治疗化疗痛的新药开发是目前该领域的研究热点。目前化疗痛动物模型已经广泛应用于研究治疗化疗痛药物的筛选及药物治疗化疗痛的分子机制当中。中医药在临床中广泛应用于治疗化疗引起的癌性疼痛。其疗效确切，可以达到增效减毒的作用。眭明红等[14]通过腹腔注射紫杉醇制备紫杉醇诱导的化疗机械痛模型，通过该模型观察电针“足三里”对紫杉醇诱导的化疗机械痛小鼠痛阈的影响及持续时间，探讨其镇痛机制。观察结果表明电针能有效抑制紫杉醇诱导的化疗所致周围神经痛，其镇痛机制可能与降低血液促炎细胞因子有关。钟敏钰等[15]通过对成年雄性SD大鼠腹腔注射紫杉醇成功制备大鼠神经病理性疼痛模型，通过该模型观察川芎嗪和普瑞巴林对大鼠疼痛的治疗效果以及探讨其止痛机制，研究结果表明川芎嗪和普瑞巴林对该化疗痛模型老鼠具有止痛效果，二者疗效相似而且联合用药具有协同增效的作用，其作用机制可能是通过降低神经系统中神经生长因子的表达来减轻神经损伤，达到止痛的效果。建立适合的化疗痛动物模型为中医药在化疗痛的发病机制和新药的研究提供了良好的研究工具。

六、皮肤癌癌痛模型的优缺点及应用

皮肤癌死亡的主要原因之一是恶性黑色素瘤，绝大多数病人在确诊时已进展到晚期,因此死亡率极高[16]。虽然疼痛不是临床上黑色素瘤的主要症状，但仍有7%的病人出现疼痛。此外，转移性黑色素瘤与疼痛有关（在某些情况下是神经性疼痛），超过50%的病人需要姑息治疗和吗啡治疗。因此对于皮肤癌的研究和治疗刻不容缓。此外，接种肿瘤细胞到后肢足底的动物表现出明显的痛觉过敏[17]。因此可以在后肢足底皮下注射肿瘤细胞构建皮肤癌癌痛模型。通过在动物后肢足底皮下注射瘤细胞构建的癌痛模型较骨癌痛模型方法操作简单易行，成瘤率高。对于疼痛的检测方法也较骨癌痛模型简单，只需通过热、机械性痛觉过敏进行检测，无需病理X线片检测。但是皮肤癌癌痛模型仍存在一定的不足之处，目前皮肤癌癌痛模型选择的部位大多数局限于四肢部位的皮肤，其余部位的皮肤癌癌痛模型目前尚未成功构建。同时对于足趾部的癌痛模型有文献表明皮下注射瘤细胞14 d后足趾部位出现破溃、出血，因此此种癌痛模型无法对口服中药制剂的止痛疗效和作用机制进行研究[18]。常用于对注射用止痛药物的疗效检测及机制研究。

近年来足跖皮肤癌是继骨癌痛和化疗痛模型之后，建立的一种新的癌痛模型。目前虽然皮肤癌癌痛模型的种类较少，但是皮肤癌癌痛模型得成功建立为研究探索皮肤癌癌痛的机制和新型治疗药物提供了一个很好的平台。谢荣等[19]通过将肿瘤细胞经皮下注射到小鼠左后爪跖面，小鼠表现出疼痛行为学的改变，成功建立足趾皮肤肿瘤模型。通过该模型研究鞘内注射阿米洛利，检测其对小鼠疼痛行为学的影响以及脊髓背角中ASIC-3蛋白表达。通过鞘内注射阿米洛利给药后，观察发现阿米洛利可提高癌性疼痛引起的小鼠热痛阈值，减轻小鼠热痛觉过敏行为反应，同时可以抑制小鼠脊髓背角ASIC-3通道蛋白的表达。该研究结果为临床治疗皮肤癌引起的疼痛提供了新的思路。Tabata等[20]通过在小鼠后肢皮下注射黑色素瘤细胞成功构建黑色素瘤皮肤动物模型。通过该动物模型观察TrkA的抑制肽对肿瘤诱导的小鼠黑色素瘤疼痛模型产生的影响，研究结果表明，TrkA受体抑制肽通过减少小鼠皮肤癌疼痛模型中足爪体积的增加，从而明显减轻黑色素瘤引起的疼痛。

七、其它癌痛模型的优缺点及应用

目前临床上出现的神经性癌痛也很普遍。对于神经性癌痛动物模型目前研究较为广泛的是通过肿瘤压迫坐骨神经成功建立的神经性癌痛模型[21]。张文学等[22]将S180肉瘤细胞接种在坐骨神经肌肉丛中，然后观察小鼠的疼痛行为学改变，成功建立小鼠坐骨神经癌痛模型。评价神经痛的普遍检测方法包括自发性行为学评分、热痛觉过敏和机械刺激等[23]。将肿瘤细胞接种在坐骨神经周围的肌肉中该造模方法较骨癌痛模型操作方法简单，成本低，周期短，成模后模型稳定，可重复性好。而且该模型与癌症病人肿瘤压迫坐骨神经产生的疼痛高度相似，可广泛用于癌性疼痛的治疗和疼痛机制的研究。

但是其它部位的神经痛动物模型目前还很少，如胰腺癌神经痛动物模型。经查阅大量文献，发现一篇关于胰腺癌癌痛模型的研究，现作一简要总结。Wang等[24]将胰腺癌细胞系SW 1990细胞移植到雌性BALB/c裸鼠胰腺上，在本研究中，小鼠胰腺癌所致疼痛模型引起小鼠明显的驼背行为和肌肉过敏反应。通过测量腹部皮肤的机械阈值检查来观察疼痛的行为反应。通过该模型对脊髓背角与疼痛相关的10个特异性基因进行了相关研究。

大多数口腔癌是口腔黏膜上皮细胞产生的鳞状细胞癌。口腔癌疼痛严重影响病人的生活，以往的研究很少报道以鳞状细胞癌为动物模型研究癌性疼痛产生的分子机制。最近katsunori等[25]将鳞癌细胞(scc-158)接种于雄性Fisher大鼠牙龈造成牙龈癌痛模型，根据该模型研究牙龈癌痛产生的病理机制，采用药理和免疫组织化学方法研究TRPV1、TRPV2在三叉神经节神经元和星型胶质细胞中表达结果，研究结果表明，TRPV1、TRPV2上调三叉神经节神经元可能在诱导的机械性痛觉过敏中起着重要的作用，此外星型胶质细胞的活化可能参与痛觉的形成。这将成为口腔癌疼痛治疗的新靶点。

八、结语

目前对于癌痛的治疗仍不理想，其病理机制仍不明确。近年来临床应用中医药治疗癌痛的研究越来越广泛。虽然中医药的止痛疗效十分显著，但是其作用机制却并不明确。各种癌性疼痛动物模型的成功建立为研究癌性疼痛的病理机制和中医药的作用机制提供了良好的平台和理论依据。但是癌性疼痛的种类繁多，目前建立的癌痛动物模型并不能满足所有的癌性疼痛的研究，如食管癌、肺癌等肿瘤引起的内脏痛模型很少有研究。同时在各种造模前可对动物的基础痛阈值进行检测，以排除动物自身基础痛阈值偏高或偏低引起后期检测的干扰，使癌痛模型更加科学、合理、规范。因此对于癌性疼痛动物模型的研究依然刻不容缓，相信随着科技的进步和对癌性疼痛的不断深入研究，在未来更多的理想的癌痛动物模型将会被成功建立，我们希望将来更多疗效确切的中医药治疗癌痛的方法能够通过各种癌痛模型来证实其功效并深入研究其作用机制，加快中医药治疗癌痛的研究与推广。