骨肉瘤耐受顺铂的机制研究进展

雍磊 刘晓光

作者单位：100191 北京大学第三医院骨科

骨肉瘤是临床最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于儿童及青少年。过去以手术为主的治疗手段只能使患者5 年生存率维持在 20% 左右，从 20 世纪 70 年代开始，化疗联合手术的治疗方案使患者的 5 年生存率达到 60%～70%[1]。然而，近 30 年来，骨肉瘤的治疗效果没有进一步的提高，这其中一个重要原因是化疗耐受的普遍发生[2]。因此明确化疗耐受机制并寻找逆转耐受的新策略成为改善骨肉瘤预后的当务之急。

自 1978 年被批准使用，顺铂已经广泛用于多种实体瘤如睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌及肺癌等的治疗[3]。作为骨肉瘤四大经典化疗药物 ( 阿霉素、大剂量甲氨蝶呤、顺铂和异环磷酰胺 ) 之一，顺铂发挥杀伤能力的基础是与 DNA 结合，造成 DNA 损伤，但其疗效被患者的遗传性或获得性耐药能力大幅削弱，单独应用时仅在 30%患者中产生应答[4]。与其它三种药物不同，顺铂是惟一含金属元素的药物，这使顺铂在某些关键途径与其它药物无交叉耐药性，所以单独阐述骨肉瘤耐受顺铂的机制具有重要的治疗价值。笔者将对骨肉瘤耐受顺铂的相关机制研究进展进行综述，以期为逆转顺铂耐受的探索提供更开阔的视角。现报告如下。

一、细胞内顺铂积累减少

肿瘤细胞内顺铂积累的减少是导致耐受顺铂的重要原因[5-6]。研究显示耐受顺铂的骨肉瘤细胞相对于其亲代，胞内顺铂积累量大幅降低 ( ＞50% )[7-8]。过去一直认为顺铂仅通过被动运输进入细胞，近年证实铜离子转运蛋白 1( copper transporter 1，CTR1 ) 介导的主动摄取是顺铂入胞的主要方式[9]。敲除酿酒酵母和小鼠胚胎成纤维细胞的CTR1 基因，二者顺铂积累分别减少 44% 和 70%，同时对顺铂的敏感性显著降低[10]。在卵巢癌和非小细胞肺癌中，CTR1 表达水平越低，肿瘤细胞中积累的铂类药物越少，患者对铂类药物的反应越差[11-12]。但骨肉瘤耐受顺铂是否与 CTR1 低表达具有潜在关系尚未见报道，值得进行探索。除了摄取减少，外排增加同样降低顺铂的积累量。药物泵出细胞的途径多样，骨肉瘤中的研究目前集中于 ATP结合盒转运蛋白 ( ATP-binding cassette transporters )。ATP结合盒转运蛋白家族是一类具有 ATP 结合位点的蛋白，通过与 ATP 结合获得能量，将多种药物排出细胞，尤以多药耐药蛋白 1 ( multidrug resistance protein 1，MDR1，又称为 P-糖蛋白 ) 及多药耐药相关蛋白 1 ( multidrug resistance-associated protein 1，MRP1 ) 活跃。MDR1 及MRP1 对于底物无选择性，大量证据显示二者高表达对骨肉瘤耐受阿霉素具有重要意义，抑制 MDR1 及 MRP1 均能增加骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性，然而，却不能实现对顺铂增敏[13-14]，这提示 ATP 结合盒转运蛋白的外排作用可能不是影响骨肉瘤细胞中顺铂积累的关键因素，其作用尚需要进一步验证。另外，两种铜转运 P 型 ATP 酶( P-type ATPase ) ATP7A 及 ATP7B 也促进顺铂耐受，它们能将顺铂隔离在细胞囊泡结构中从而减少细胞内的有效顺铂积累量或介导顺铂泵出细胞[15]。在耐受顺铂的肿瘤中，ATP7A 及 ATP7B 表达上调[16-17]；然而，骨肉瘤中也尚无关于 ATP7A 及 ATP7B 的研究。

二、细胞解毒能力增强

顺铂进入细胞后，胞内低氯离子环境使顺铂的氯配体解离，同时铂离子络合水分子，形成带正电的高活性水合分子。这种水合分子仅少部分与 DNA 结合，其余绝大部分被胞内亲核物质结合而失去活性，其中最重要的亲核物质是谷胱甘肽 ( glutathione，GSH )[3]。早在 1998 年，Komiya 等[18]就在 8 株骨肉瘤细胞中发现细胞内 GSH 水平越高，顺铂的半数抑制浓度就越大；进一步用丁硫氨酸-亚砜亚胺抑制 GSH 合成过程中的关键酶后，顺铂的杀伤效力明显增强。GSH 与顺铂除了能直接结合外，还能在谷胱甘肽 S 转移酶 P1 ( glutathinoe S-transferase P1，GSTP1 )的催化下快速反应，Huang 等[19]报道顺铂上调骨肉瘤细胞 SaOS-2 和 HOS 中 GSTP1 的表达，在 SaOS-2 细胞中过表达 GSTP1 后，细胞对顺铂的抵抗能力增强；相反，在HOS 细胞中干扰 GSTP1 的表达后，细胞对顺铂的敏感性上升。单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms，SNP ) 分析显示骨肉瘤患者携带 GSTP1 rs1138272 与无瘤生存期和总生存期相关[20]。Pasello 等[21]在 34 例骨肉瘤患者中发现 GSTP1 水平越高，肿瘤复发可能越大，患者无瘤生存期越短；进一步将顺铂与 GSTP1 抑制剂序贯干预细胞，显示出协同抗肿瘤效应。

三、DNA 损伤修复或耐受增强

顺铂水合分子倾向于结合 DNA 嘌呤碱基的 N7 位点，形成顺铂-DNA 交联物，其中绝大部分为链内交联，少部分为链间交联。细胞若不能修复或耐受 DNA 损伤，就会启动下游凋亡途径；反之，部分细胞能修复或耐受这些 DNA 损伤从而耐受顺铂。核苷酸切除修复 ( nucleotide excision repair，NER ) 是修复链内交联的主要方式，其过程包括识别、切除、修复及接合。参与 NER 的蛋白众多，其中促成顺铂耐受的关键因子包括切除修复交叉互补基因 1 ( excision repair cross-complementation group 1，ERCC1 )、着色性干皮病基因 F [ xeroderma pigmentosum( XP ) complementation group F，XPF ]、XPD 及 XPG。ERCC1 与 XPF 形成异源二聚体在 5' 端切除 DNA 损伤，研究显示 ERCC1 的 SNP 与骨肉瘤患者的无瘤生存时间有关[22]，且 ERCC1 表达越高，患者无瘤生存期与总生存期越短[23]；在骨肉瘤细胞中用 shRNA 沉默 XPF 后，顺铂对细胞的杀伤效力显著提高[24]。XPD 与 XPG 也参与损伤 DNA 的切除，骨肉瘤中二者的 SNP 也与患者的无瘤生存期相关[25]；且抑制 XPG 表达后，骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性增加[24]。错配修复 ( mismatch repair，MMR ) 是在DNA 复制或重组过程中纠正错配碱基的方式，也是修复DNA 链内损伤的一种方式，在骨肉瘤中，参与 MMR 的蛋白 MSH2 和 MSH6 高表达与化疗不敏感相关[26]。另外，同源重组 ( homologous recombination，HR ) 能修复顺铂造成的链间交联损伤，RAD51 蛋白参与 HR 途径，研究显示干扰 RAD51 能够提高顺铂对骨肉瘤细胞的毒性作用[27]；新近发现范科尼贫血 ( fanconi anemia，FA ) 通路也能介导HR 修复，该通路被抑制后，骨肉瘤对顺铂的敏感性也增加[28]。除了修复能力增强，对 DNA 损伤的耐受也能使细胞抵抗顺铂。跨损伤 DNA 合成 ( translesion DNA synthesis，TLS ) 是一种重要的 DNA 损伤耐受方式，它可以利用低保真性的聚合酶使细胞在 DNA 损伤存在的情况下，依然能够继续复制 DNA。在骨肉瘤细胞中，削弱 TLS途径也能增强顺铂的杀伤效应[28]。

四、凋亡信号通路减弱

诱导细胞凋亡是顺铂-DNA 交联物发挥细胞毒性的主要方式。所以，凋亡相关通路信号的抑制或缺失将会减弱顺铂的细胞毒性作用。参与凋亡的通路及蛋白多样，如磷脂酰肌醇 3-激酶 / 丝氨酸或苏氨酸激酶 ( PI3K / Akt )通路、p38 丝裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 通路、肿瘤抑制因子 p53 及抗凋亡蛋白等。肿瘤中 PI3K / Akt 通路能影响凋亡、增殖、分化等多方面表型，研究证实该通路的异常激活参与骨肉瘤的发生发展[29]，同时，PI3K / Akt 通路也介导骨肉瘤耐受顺铂，抑制该通路能显著增强细胞对顺铂的敏感性[30-31]。作为MAPK 超家族的一员，p38 MAPK 通路是顺铂诱导的主要凋亡相关通路之一，该通路的抑制能够使肿瘤耐受顺铂[32]。在骨肉瘤中，已经证实外源激活 p38 MAPK 通路具有对顺铂增敏的效果[33]。p53 在药物诱导细胞凋亡发生过程中十分重要，但肿瘤中 p53 基因多发生突变，骨肉瘤中 p53 突变率高达 31%～82%，且大部分为功能丧失性突变[1]；在耐药的骨肉瘤细胞系中，导入 p53 基因能显著提高细胞对顺铂的敏感性[34]。抗凋亡蛋白表达增加能抑制凋亡的发生，B 淋巴细胞瘤-2 ( B-cell lymphoma-2，Bcl-2 ) 蛋白家族是直接参与调控内源性凋亡通路的关键蛋白，Bcl-2 及Bcl-xL 蛋白表达下调是启动内源性凋亡通路的关键信号。在化疗耐受的肿瘤中，Bcl-2 普遍高表达[35]。在骨肉瘤中，Bcl-2 及 Bcl-xL 表达上调也使细胞耐受顺铂[36-37]。

五、自噬相关耐药

自噬是自噬体与溶酶体共同介导的物质降解过程，包括启动、囊泡成核、囊泡延伸、囊泡封闭、囊泡成熟、与溶酶体融合 6 个阶段。虽然自噬与凋亡的关系存在争议，但越来越多证据显示自噬能帮助肿瘤细胞抵抗化疗药物引起的凋亡，使其获得耐药性[38]。Jiang 等[39]发现耐受顺铂的骨肉瘤细胞的自噬水平显著升高。蛋白激酶 ULK1 复合物是自噬体形成的起点，正常情况下，ULK1 及 ATG13( ULK1 复合物的组成部分 ) 被哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 C1( mTORC1 ) 磷酸化而处于非活性态；饥饿时，mTORCT1去磷酸化，ULK1 得以活化，进而启动后续自噬过程。研究显示在骨肉瘤细胞中，顺铂能激活 SRC 激酶-AMP 依赖的蛋白激酶 ( AMPK ) 信号通路，活化的 AMPK 通路抑制 mTOR，从而诱导自噬；氯喹可以抑制自噬体与溶酶体的融合，体内成瘤实验显示氯喹与顺铂联合相对于顺铂单药，抗骨肉瘤效果明显增强[40]。III 型 PI3K ( PI3KC3 )-自噬相关蛋白 Beclin1 复合物参与囊泡成核。在骨肉瘤细胞中，顺铂通过上调高迁移率族蛋白 1 ( high mobility group box 1，HMGB1 ) 来促进 PI3KC3-Beclin1 复合体的形成，诱导自噬相关耐受[41]。

六、非编码 RNA 相关耐药

微小 RNA ( microRNA，miRNA ) 是一类长度通常为18～25 个核苷酸的单链非编码 RNA，它在转录后水平抑制靶基因 mRNA，从而发挥相应作用。通过对比分析肿瘤 / 瘤旁组织或顺铂敏感 / 不敏感组织及细胞的 miRNA表达谱发现，骨肉瘤中的以下改变均促进对顺铂的耐受：miRNA-221[42]及 miRNA-33a[43]表达上升；miRNA-497[44]、 miRNA-138[45]、 miRNA-199a[46]、 miRNA-223[47]、miRNA-20a[48]、miRNA-22[49]、miRNA-34c[50]、miRNA-491[51]及 miRNA-340-5p[52]表达下降。长链非编码 RNA ( long non-coding RNA，lncRNA ) 是长度＞200 个核苷酸的非编码 RNA，它能在基因、转录及转录后多个水平影响肿瘤的生物学行为。骨肉瘤中高表达的 lncRNA HOTTIP 激活 Wnt / β-catenin 通路，高表达的 lncRNA NEAT1 抑制 miRNA-34c，削弱顺铂的杀伤效应[53-54]。lncRNA LINC00161 能通过上调干扰素诱导基因 2 ( IFIT2 )的表达来增强顺铂诱导凋亡的能力，在耐受顺铂的骨肉瘤细胞中，LINC00161 呈低表达[55]。与 miRNA 及 lncRNA 这些线性 RNA 不同，环状 RNA ( circular RNA，circRNA ) 呈封闭环状结构，近年研究显示 circRNA 如 circPVT1[56]和circ_001569[57]也参与促进骨肉瘤耐受顺铂。

七、肿瘤微环境相关耐药

肿瘤微环境指肿瘤细胞生长的局部条件特征，包括细胞成分如免疫细胞及纤维细胞等及理化因素如温度、pH值等。研究发现，在 42 ℃ 及 43 ℃，顺铂 ( 5 μg / ml ) 杀死骨肉瘤细胞的效率相对 37 ℃，分别提高 0.9 及 1.6 倍[58]。肿瘤局部的压力变化也能影响细胞对顺铂的反应，Nathan等将肿瘤切除术中监测到的肿瘤组织液压与 12 例骨肉瘤患者对包含顺铂在内的化疗方案的反应好坏进行相关性分析显示，好的预后与高的肿瘤组织液压呈正相关；进一步细胞实验提示高压环境下，肿瘤增殖能力更强，从而对顺铂的反应更敏感[59]。另外，有研究发现 pH 降低时 ( pH＝6.5 )，骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性也随之降低[60]。实体瘤内部通常呈现低氧状态，大量证据表明低氧促进对化疗的耐受[61]。低氧同样促进骨肉瘤耐受顺铂，然而，与其它多数类型肿瘤不同，骨肉瘤中低氧介导的顺铂耐受是通过激活 PI3K / Akt 通路实现的，而不是抑制低氧诱导因子 1( hypoxia inducible factor-1，HIF-1 ) 的表达[62-63]。

八、肿瘤干细胞相关耐药

肿瘤干细胞学说认为肿瘤起源于一小团具有自我复制及分化能力的恶性细胞，即肿瘤干细胞。肿瘤干细胞构成整个肿瘤组织的一小部分，其相对于已分化的肿瘤细胞更加耐受化疗[64]。从骨肉瘤细胞系中培育出的具有肿瘤干性特征的细胞对顺铂更加抵抗[65]。Notch 信号通路是维持肿瘤干细胞特征的关键因素[64]，Notch 通路抑制剂 DAPT 能减弱耐受顺铂的骨肉瘤细胞系的干性特征，并增加它们对顺铂的敏感性[66]。但骨肉瘤干细胞获得顺铂抵抗的机制尚不清楚。Shang 等[67]检测到 M2 型丙酮酸激酶 ( pyruvate kinase isoenzyme M2，PKM2 ) 在骨肉瘤干细胞中表达上调，PKM2 能促进三磷酸腺苷 ( ATP ) 的产生，提示能量供应的增加可能与耐药产生有关。

九、其它

失巢凋亡 ( anoikis ) 是细胞脱离其贴附的基质后发生的程序性死亡，能防止细胞在不适宜的地方种植并生长。肿瘤细胞能通过某些途径抵抗失巢凋亡，发生转移与扩散。骨肉瘤细胞获得抵抗失巢凋亡的能力后，对顺铂的耐受能力也增强了 1～6 倍[68]，提示二者可能具有一定关系。除了直接扩散，细胞也能分泌外泌体与邻近或远处细胞沟通。外泌体是 50～100 nm 大小的微囊泡，内含蛋白质、脂质、mRNA 及丰富的 miRNA 等。在神经母细胞瘤、肺癌及胃癌中，外泌体通过运输特定 miRNA 使细胞耐受顺铂[69-71]。如前所述，多种 miRNA 能介导骨肉瘤耐受顺铂，那么在骨肉瘤中，外泌体是否参与传递相应miRNA 的信息，从而促进顺铂耐受，值得进一步探究。

骨肉瘤的预后取得长足改善始于化疗药物的应用。而今多药耐药局面的出现，为临床治疗骨肉瘤提出巨大的挑战。骨肉瘤耐受顺铂的机制多样且复杂，目前已经有一些研究针对这些耐药机制来尝试克服对顺铂的耐受，包括抑制细胞解毒能力[21]、抑制 DNA 损伤修复[28]、多药联合增强凋亡通路信号[33]等。需要注意的是，这些耐药机制往往不是单一发挥作用，而是多途径共同影响顺铂敏感性，这给降低骨肉瘤对顺铂耐受的探索带来困难。近年来，免疫疗法成为肿瘤治疗的热点，但骨肉瘤中的临床试验效果都不令人满意[72-73]。所以，对包括顺铂在内的经典化疗药物的耐受研究依然任重道远。相信随着对顺铂耐药机制理解的深入与透彻，将会产生有力可靠的逆转顺铂耐药的方法，为骨肉瘤的治疗带来新的希望。