3D生物打印在组织工程中的应用

左进富 孙淼 韩宁宁 刘方军

【提要】 3D生物打印技术是一种以计算机三维模型为“图纸”，装配特制“生物墨水”，最终制造出人造器官和生物医学产品的新科技手段。3D打印技术在生物医学领域的应用近几年获得快速发展，具有良好的发展前景和巨大的社会价值，本文对其在组织工程及器官再造等方面的应用进行综述。

3D打印技术是上世纪80年代出现的一种快速成型技术，由计算机辅助设计（CAD）数据通过成型设备，以材料逐层堆积的方式实现三维实体成型[1-2]。普通打印机的打印材料是墨水和纸张，而3D打印机与传统打印机最大的区别在于其使用的“墨水”是实实在在的原材料（金属、陶瓷、细胞等），通过电脑控制可以把这些“打印材料”实现立体化而打印出3D实物模型。通俗地说，3D打印机是可以“打印”出真实的3D物体的一种设备。3D打印技术根据凝合成型技术的不同可分为光固化立体光刻、熔融沉积制造、选择性激光烧结、叠片实体制造和3D喷印[3]。3D打印已在许多领域展现出巨大的应用潜力和实用价值。

1 3D打印在心血管领域的应用

1.1 心脏瓣膜

利用3D生物打印技术制备的可移植用心脏瓣膜，可克服传统瓣膜移植术所存在的问题。3D生物打印具有以下的优点：①根据造影或者心脏血管CT打印出的瓣膜更符合心脏的解剖结构，减少或消除了因大小不匹配等问题带来的困扰，制造出真正与患者相匹配的瓣膜；②取材患者自己的细胞，彻底杜绝免疫排异反应的产生；③相比传统瓣膜，可减少抗凝药物的服用周期[4]。有研究通过经食管心脏超声获取人二尖瓣的动态影像学数据，再使用立体光刻3D打印技术，分别构造出了二尖瓣在收缩期和舒张期的实体模型，全过程仅仅用了30 min。该研究通过模拟组织结构、大小、体积的3D图像重建及模拟定量可视化打印，使得3D生物打印自体组织移植物成为可能[4]。Lueders等[5]利用水凝胶和脐带血干细胞打印出了具有良好生物功能特性的心脏瓣膜。

1.2 血管

既往人造血管因无法产生内皮细胞而存在以下缺点：①人造血管体内移植后易发生堵塞、凝血等问题；②移植传统人工血管的患者需终身服用抗凝药；③传统人工血管的使用寿命短，仅10年左右。利用3D生物打印技术打印出来的生物血管因能够生成血管内皮细胞层而有利于血液流动，患者术后服用抗凝剂的时间也可缩短到5 d左右，此后无需任何药物治疗，而且3D打印血管可终身使用。

3D生物打印血管技术利用提取的生物自体间充质干细胞制备成生物墨汁，应用于3D打印设备，构建出具有生物活性的人工血管。将其置换到生物体内后，3D血管通过再生分化与正常血管融合，且功能和结构保持一致，术后血管的各项生物检测指标在一定时间内未发现任何异常。有研究提取恒河猴的ADSC进行体外培养扩增，随后用独创的“生物砖”技术将ADSC转化成生物“墨汁”用于3D生物血管打印而构建出了人造血管，植入实验动物自体体内后，人造血管成功存活并再生形成了具备一定功能的血管组织。

2 3D打印在骨组织工程中的应用

目前，临床修复骨缺损的骨组织移植材料有自体骨、同种异体骨和人工骨，其中自体骨来源有限及供体部位的二次伤害是临床应用中的最大弊端；同种异体骨存在材料来源限制及潜在疾病感染等问题；人工骨存在无法专属定制、加工周期长、结构尺寸难与患者骨损坏部位匹配，以及免疫排斥等缺点[6]。骨组织工程的出现为解决这一难题提供了新思路。骨组织工程的研究包括多孔生物材料支架、成骨种子细胞和促骨生长因子三个要素。成骨细胞在骨组织工程支架材料上的黏附、增殖、分化直接关系到骨损伤修复的成败[7-8]。骨组织工程生物支架材料应具有三维多孔的超微结构且支架内部孔隙间交融贯通，其适合的孔隙率、良好的生物相容性及足够的比表面积可在一定程度上保证黏着的种子细胞的密度、细胞营养液的输送和代谢产物的排放，有利于促进成骨细胞的增殖、分化以及在三维多孔结构内的均匀扩散附着[9-10]。

3D生物打印技术利用骨缺损病变部位的CT/MRI成像数据用于计算机三维设计，并精确制作个性化的3D生物材料支架，实现了生物支架与骨缺失病变部位的完美匹配，并可有效模拟正常骨组织的微观结构。3D生物打印在组织工程支架材料的微观和宏观结构构建方面具备前所未有的精确性，同时3D打印技术制备的骨组织工程支架在机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性等方面均具有独特的优势[11-12]。Tay等[13]使用微粒过滤法过滤后的聚己内酯和聚乙烯醇混合粉末为生物墨水材料进行3D生物打印，制备的骨组织工程支架具有足够的韧性，孔隙率较高，连通性能好，基本满足了骨组织工程支架的三维多孔要求。赖毓霄等[14]利用低温3D打印技术，将镁有机复合入聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、β-磷酸三钙（TCP）多孔支架中，设计制造了具有生物活性的可降解PLGA/TCP/Mg多孔支架，并对该材料的三维结构、力学性能及体内外生物活性进行了研究。实验数据证明，利用新型低温3D打印技术制备的PLGA/TCP/Mg多孔支架具有良好的相互连接的多孔结构及适宜骨重建的机械强度。体内外实验也表明PLGA/TCP/Mg支架具有良好的生物相容性和生物活性，有利于植入部位成骨发生及血管组织的长入。张海峰等[15]采用3D打印技术打印出了聚乳酸－羟基磷灰石复合支架并复合骨髓基质干细胞进行体外培养，结果表明骨髓基质干细胞能够在复合材料上有效黏附生长，3D打印聚乳酸－羟基磷灰石复合材料具有良好的细胞相容性，可作为骨组织工程的支架材料。

3 3D打印在软骨组织工程中的应用

上世纪90年代，曹谊林在裸鼠体内成功构建人耳郭形态软骨，为临床软骨缺损的修复提供了极具前景的新思路。但是，传统组织工程研究仍存在一些技术上的难点，特别是生物支架材料超微结构的三维构建将直接影响到种子细胞的有效黏附、均匀分布及其增殖分化，最终影响到软骨组织的再生及修复缺损的效果。

近几年，3D生物打印被逐渐引入到组织工程研究领域中。研究表明，通过3D生物打印技术制备出来的组织显示出良好的再生能力[16]。3D生物打印技术与干细胞的整合在组织工程领域表现出了巨大的潜力。利用3D生物打印技术打印出来的组织工程支架具备复杂的内部三维多孔结构，能够满足细胞的黏附与增殖，更重要的是，支架外形可以与缺损组织的解剖结构相匹配[17]。利用3D打印技术，可于时间和空间上精确、按需沉积不同种类的生物材料（包括细胞、具有生物相容性且可降解的水凝胶、生长因子等），在制造任意复杂形状支架的同时，可有效制定支架的孔隙率、孔径大小等尺寸参数，促进细胞增殖和组织再生，从而解决传统软骨组织工程存在的不足[18]。

袁清献等[19]以丝素蛋白和Ⅱ型胶原为支架材料打印网格状的3D支架模型，力学性能试验测得支架弹性模量具有率相关性，在支架接种软骨细胞后，细胞能够在支架上黏附增殖，这表明3D打印的网格状结构的丝素蛋白-Ⅱ型胶原支架是适合软骨细胞生长的，满足组织工程中骨关节的软骨修复要求。Cathal等[20]以 GelMa/HAMa作为基底材料，加入脂肪干细胞后，用生物打印笔装置在软骨损伤部位进行原位打印，并通过UV光源照射固化。实验结果表明，经3D打印成型的干细胞具有较高的存活率，并有利于软骨损伤的愈合修复。徐奕昊等[21]取20例人鼻中隔软骨，经分离、培养、扩增后，接种于依照3D打印技术制备出的鼻翼软骨PGA/PLA支架上，植入裸鼠皮下培养8周，构建的组织工程化软骨在形态及组织结构上与人软骨无明显差异。

4 3D打印技术在器官再造中的应用

目前，等待器官移植的患者呈逐年递增的趋势，但供体供不应求，同时异体器官移植后需长期服用免疫抑制剂，患者的生活质量受到严重影响。据报道，中国每年因末期器官衰竭而需要器官移植的人大约有150万，但实际只有不到1万的器官可供移植，供求比例达到1∶150[22]。而人体器官3D打印技术的发展可能会为这些患者提供一线希望。Charles Hull于1986年开发出了第一台3D印刷机，2005年首个高清晰彩色3D打印机亦研制成功，随着3D打印技术的迅猛发展，现如今人体器官的3D打印亦成为可能。3D生物打印是3D打印技术在医学领域最高层次的应用，首先以生物降解材料为“油墨”搭建细胞生长繁殖所需的微环境和三维空间构架，将自身成体干细胞和包含细胞分化因子在内的生物材料混合后作为具有活性成分的 “生物油墨”，3D打印出具有生物活性的人造组织器官[23]。活体组织与器官打印的原材料包括活体细胞材料和可用作细胞生长支架的水凝胶，由于3D生物打印的种子细胞来源于患者自身，不仅有效免除了异体组织器官移植存在的免疫排斥反应，还有效解决了器官供不应求的问题，促进了人造组织器官的发展。

2013年，有研究在人耳解剖结构的基础上，利用3D打印细胞接种的水凝胶基质，以及银纳米颗粒组成的交织导电聚合物生成了一个仿生耳。打印出来的耳朵表现出增强的射频接收听觉感应，并且互补的左耳和右耳可以收听立体声音频[24]。国际空间站上的3D生物打印机，在零重力下3D打印出了实验鼠的甲状腺。在零重力环境下，3D打印出来的器官和组织比在地球上要成熟得更快，因此效率更高。该项新研究可能为未来在国际空间站3D打印人体器官铺平道路[25]。2017年，Kizawa等[26]采用3D打印技术成功制造出迷你版的具有生物活性的人类肝脏组织，能代谢药物、葡萄糖以及脂质，分泌胆酸，其功能可以维持数周。

人体器官3D打印技术相对传统的医疗手段表现出独特的价值，既可解决供体器官供不应求的问题，又可有效避免异体免疫排斥反应。随着3D生物打印的发展，有望使器官移植在不远的将来取得突飞猛进的进展。

5 展望

3D打印正在多个垂直行业颠覆制造过程，尤其是在医疗领域，导致了更多创新、高效的产品出现。全球3D打印医疗垂直应用市场，预测从2013年至2019年的年复合增长率将达到15.4%。

3D打印技术正处在蓬勃兴起的阶段，大大扩展了一些疾病的治疗前景，改变了传统组织工程的部分理念。3D打印给人类生物医学提供了无限的应用可能和想像空间。随着材料学和计算机技术的不断发展，以及再生医学、组织工程和分子生物学领域研究的深入，3D生物打印技术可为组织修复和器官移植带来更加光明的前景。