护心康对TLR4-/-小鼠动脉粥样硬化模型β-catenin的影响

董晓斐，丁小玉，贺佳幸，屈 波

（1．湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2．湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病机制尚未阐明，目前研究表明有很多诱发因素与之相关，国内外公认与血脂代谢紊乱有关，尤其是高脂血症的存在[1]。近来研究发现：Wnt信号通路与动脉粥样硬化和冠心病的发病密切相关[2]，可能成为控制动脉粥样硬化的新型靶点。TOLL样受体4（TOLL-like receptor 4，TLR4）激活可以介导AS血管壁炎症，抑制TLR4是否会影响Wnt信号的表达，目前尚未见报道。既往研究表明，护心康对AS的防治具有较好的疗效，本研究通过TLR4-/-小鼠AS模型，观察Wnt信号通路中β-catenin的变化及护心康的干预作用，探讨护心康防治AS的作用机制，为AS的治疗及临床用药提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

S P F级T L R 4基因敲除小鼠7 0只，6周龄，（20.3±2.5）g，雄性，购自南京大学模式动物研究所，合格证号：201800971.普通饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供，高脂饲料由上海普路腾生物科技有限公司生产提供，动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。实验过程中，所有研究人员均人道地进行动物实验，严格遵守动物实验的各项伦理条例。

1.2 药物

阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司生产，规格20 mg/片，国药准字国药准字H20051408）。护心康片（湖南省中医研究院附属医院制剂室生产，批号为（湘）卫药剂（2003）12第039号），由瓜蒌皮、薤白、陈皮、远志、法半夏、茯苓、荜澄茄、石菖蒲、旋覆花、隔山消、苦杏仁、茜草、三七、丹参、蒲黄、五灵脂、琥珀、北山楂、葳蕤、黄芪、炙甘草等组成，每片含生药0.3 g。

1.3 主要试剂与仪器

胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯检测试剂盒及检测仪器cobas8000全自动生化分析仪由罗氏诊断产品上海有限公司提供；β-catenin兔抗小鼠单克隆抗体、PV-6002羊抗小鼠IgG/HRP聚合物由美国GBI公司提供；WIF由美国R&D公司提供；Olympus BX-51光学显微镜及数码摄影系统由日本奥林帕斯公司生产。

1.4 模型建立及处理

SPF级TLR4-/-小鼠共70只，雌雄各半，随机取12只为正常对照组，予以普通饲料喂养；其余58只予以高脂饲料喂养13周，饲料含脂肪21%，胆固醇0.15%[3]。13周后随机抽取5只解剖观察胸主动脉，光镜下发现斑块为造模成功；造模过程中死亡5只小鼠。造模成功的动物随机分为模型组、护心康组、阿托伐他汀组、Wnt抑制剂WIF组，每组12只，分别予以相应处理。正常组不做处理，其余各组均予灌胃和腹腔注射处理，灌胃容积均为0.5 mL、腹腔注射容积均为0.3 mL，1次/d。模型组予以生理盐水灌胃并腹腔注射；护心康组按动物与人体间的等效换算法，按生药剂量21.6 g/kg·d灌胃，腹腔注射生理盐水；阿托伐他汀组按3 mg/（kg·d）灌胃，腹腔注射生理盐水；Wnt抑制剂WIF用量为2 ug，生理盐水稀释后腹腔注射，生理盐水灌胃，上述处理时间均为8周。

1.5 观察指标

于第21周末，3%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，进行心脏采血，使用酶比色法检测血脂，按照试剂盒说明书进行操作。然后打开小鼠胸廓充分显露心脏，将主动脉分离出来，取胸主动脉固定于4%的多聚甲醛中，取小鼠主动脉血管，乙醇脱水及二甲苯透明后石蜡包埋切片，常规脱腊脱水后进行HE染色，光镜下进行病理学观察。免疫组织化学法测定β-cateninn，以标本出现棕黄色为阳性显色；OlympusBX-51光学显微镜400 倍观察切片，应用Image Pro Plus 6.0图像分析系统进行光密度分析，每张切片分析5个连续的视野， 取其均值为该标本测量结果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD和Dunnet检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血脂检测

造模后动物的血脂水平比正常组明显升高（P＜0.05），其中高密度脂蛋白的升高考虑是机体受到胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的刺激后产生的应激性增高，属于保护性；阿托伐他汀和护心康对胆固醇和低密度脂蛋白的升高具有明显的疗效（P＜0.05），WIF的对其的降低作用不明显；三种药物对甘油三酯和高密度脂蛋白的影响相对较小，见表1。

表1 各组血脂检测（±s，mmol/l）

表1 各组血脂检测（±s，mmol/l）

注： 与正常组相比aP＜0.05，与模型组相比bP＜0.05；与他汀组相比cP＜0.05

组别 n 胆固醇 甘油三酯 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白正常组 12 1.85±0.23 1.21±0.25 0.45±0.37 1.42±0.35模型组 12 3.21±0.50a 2.52±0.45a 0.92±0.26a 2.64±0.41a阿托伐他汀组 12 1.83±0.37b 1.68±0.40 0.36±0.19b 1.80±0.34 WIF组 12 2.97±0.28c 1.74±0.25 0.73±0.20a 1.96±0.23护心康组 12 2.01±0.36b 1.81±0.52 0.43±0.28b 1.83±0.29

2.2 病理学观察

造模过程中小鼠死亡5只。21周后观察光镜胸主动脉。正常组无斑块形成，主动脉管壁分层清楚，内膜平整光滑，内皮细胞排列整齐，平滑肌细胞走形良好。模型组动脉内膜明显增厚，大量斑块形成，血管腔明显减小，表明造模成功。各药物干预组亦内膜均有不同程度增厚，伴有粥样斑块形成，但斑块病变减轻，斑块面积变小，泡沫细胞减少，见图1。

2.3 β-catenin蛋白的表达

细胞胞浆可见的棕黄色颗粒为β-catenin蛋白的阳性表达，棕黄色颗粒越多，表达越明显。高脂造模后，模型组中β-catenin蛋白表达明显高于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，三种药物均能降低β-catenin ，Wnt抑制剂WIF降低作用较强（P＜0.01），护心康组和阿托伐他汀组也有明显的降低作用（P＜0.05）；WIF降低β-catenin的作用较阿托伐他汀强（P＜0.05），图2、表2。

图1 各组病理学改变（HE染色，×100）

图2 各组β-catenin的表达（HE染色，×400）

表2 免疫组化检测β-catenin蛋白表达（±s）

表2 免疫组化检测β-catenin蛋白表达（±s）

注： 与正常组相比aP＜0.01；与模型组相比bP＜0.05；cP＜0.01；与阿托伐他汀组相比dP＜0.05

组别 n β-catenin正常组 12 15.13±4.54模型组 12 40.27±5.16a阿托伐他汀组 12 35.52±4.60ab WIF组 12 31.30±5.63abcd护心康组 12 36.67±4.71ab

3 讨 论

实验和临床研究表明，动脉粥样硬化的发生与高血脂有密切关系，高血脂可以导致血管内皮细胞功能障碍，脂质沉积，同时诱发单核细胞浸润血管壁，，吞噬脂质形成泡沫细胞，诱发慢性血管炎症，导致血管壁增厚，管腔狭窄。Wnt是由19个蛋白分子构成的分泌蛋白家族，通过分泌蛋白与细胞膜上的受体结合，激活相应的基因表达，从而影响细胞粘附和炎症因子的释放等生理病理过程。Wnt信号通路分为经典和非经典两大类，Wnt/β-catenin信号通路属于经典型通路，居于Wnt通路中研究之首。Wnt与其受体卷曲蛋白或低密度脂蛋白受体相关蛋白结合，通过一系列反应，导致细胞内β-catenin增多，进而与T细胞因子/淋巴细胞增强因子发生相互作用，激活Wnt信号通路相关靶基因，从而影响下游炎症反应和细胞粘附[4]。β-catenin蛋白属于Wnt /β-catenin 通路的上游因子，表达于内皮细胞中。研究表明：动脉粥样硬化斑块中β-catenin的基因和蛋白表达明显升高，提示Wnt/β-catenin信号通路参与了AS的形成[5]。激活血管内皮细胞的Wnt/β-catenin信号通路，可以导致内皮功能障碍，单核细胞对内皮细胞的黏附性增强，使单核细胞易于和内皮粘附，从而诱发血管壁炎症[6]。β-catenin也可激活Wnt/β-catenin通路，进而导致促炎细胞因子的表达释放，表明Wnt/β-catenin通路在炎症反应中发挥着重要的作用[7]。激活Wnt信号通路可导致脂代谢紊乱，损伤内皮细胞，说明其与高血脂有密切关系[8]。以上研究都提示：Wnt信号通路与动脉粥样硬化形成的多个环节有关，尤其是高血脂和炎症反应有关，主要作用靶点为内皮细胞和单核细胞。

中医学认为，动脉粥样硬化的主要病理基础是痰浊和瘀血，因此治疗中常常贯彻活血化瘀和祛痰消浊。护心康主要具有消痰散结和活血行瘀的作用，在临床冠心病的治疗中取得了较好的疗效。研究发现：护心康对痰瘀阻络型冠心病具有较好的疗效，能有效改善心绞痛的发作症状和心电图表现[9]；同时提高患者的生存质量[10]。护心康可以降低冠心病患者血清超敏C反应蛋白和sICAM-1水平[11]，血清超敏C反应蛋白是判断炎症的灵敏指标，其表达下降可以降低单核细胞分泌炎症因子；血清sICAM-1含量降低可以减少炎症反应导致的细胞黏附，护心康通过降低二者的表达，减轻炎症反应，延缓冠心病的发生发展。

我们前期以兔动脉粥样硬化为模型的实验中，发现护心康能有效降低血脂[12]，抑制动脉粥样硬化斑块中TLR4、TNF-α的表达[13-14]，并抑制内皮细胞MyD88 和TRAF6基因的表达[15]，这些作用共同合力可以起到延缓血管壁炎症的作用。敲除TLR4基因对动脉粥样硬化的发生和发展有和影响呢？本实验研究显示：高脂饲料喂养的TLR4-/-小鼠，血脂水平明显升高；光镜下观察发现内膜增厚，动脉粥样硬化斑块形成，血管腔狭窄；说明单纯抑制TLR4并不能杜绝高脂诱发的动脉粥样硬化发生，即动脉粥样硬化是由多因素共同作用而成，单一靶点的处理很难起到一锤定音的效果。免疫组化测定模型组中β-catenin的表达水平较正常组明显增高，进一步证实动脉粥样硬化与Wnt信号通路存在紧密联系。分别采用降血脂药物阿托伐他汀、Wnt抑制剂WIF及中药复方护心康对AS模型进行干预，结果显示三种药物均能抑制β-catenin，其中Wnt抑制剂组降低β-catenin的作用较阿托伐他汀和护心康强，其中护心康和阿伐他汀可以明显降低血胆固醇和低密度脂蛋白。我们推测，护心康可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，减弱下游的炎症反应，从而起到抑制动脉粥样硬化的作用。